微RNA-375对非小细胞肺癌脑转移的诊断价值

王大鹏，夏庆欣

作者单位：郑州大学附属肿瘤医院病理科，河南 郑州450000

肺癌居全球范围内癌症发病率和死亡率的首位，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%～85%。我国近年来肺癌的发病率和死亡率明显升高［1］。肺组织淋巴和血供非常丰富，癌细胞极其容易经邻近的淋巴管或血管转移至远处器官，肺血管和椎静脉间常有吻合支，因而更容易转移至脑部［2］。据报道，NSCLC病人脑转移的发生率约20%～40%，其中同时性脑转移占10%～30%，即病人在初次确诊时已经出现脑转移，异时性脑转移占70%～90%，即在治疗后和随访过程中发生脑转移［3］。miRNA（miR）是真核生物体内的一类非编码小RNA分子，具有良好的稳定性，广泛参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程，miR已逐渐被用于表征肿瘤，miR的调节失调与多种癌症的发生、发展有关，但miR-375在脑转移中的作用是一个全新的研究领域［4］。本研究采用实时荧光定量PCR检测受试者血清miR-375表达水平，并探讨其在NSCLC脑转移的诊断和预后评估中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年2月至2015年2月郑州大学附属肿瘤医院收治的185例初诊NSCLC病人为研究对象，纳入标准：①符合NSCLC的诊断标准［5］；②经细胞学或病理学确诊为NSCLC；③初次确诊；④预计生存时间超过3个月；⑤入院前未接受过抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他器官功能障碍；②合并其他恶性肿瘤史；③先前有或继发性恶性肿瘤；④曾接受过免疫治疗或放化疗。其中发生脑转移病人78例纳入转移组，年龄范围为30～78岁，年龄（58.63±12.15）岁；男性53例，女性25例；病理类型：腺癌50例，鳞癌28例；临床分期：Ⅳ期78例；淋巴结转移：29例N0，14例N1～2，35例N3。未发生脑转移病人107例纳入未转移组，年龄范围为30～80岁，年龄（59.24±12.33）岁；男性71例，女性36例；病理类型：腺癌69例，鳞癌38例；临床分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ46期例，Ⅳ期34例；淋巴结转移：16例N0，35例N1～2，56例N3。另选择80同期健康体检者为对照组，年龄范围为31～80岁，年龄（59.29±12.37）岁。三组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得病人及家属知情同意，且符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集受试者空腹静脉血5 mL，4℃下3 000 r/min离心15 min，吸取上清液至2 mL EP管中，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miR-375的检测 ⑴血清总RNA提取：吸取200 μL血清，按照mir VanaTMPARIS试剂盒（Ambion，美国）说明书操作完成总RNA提取。⑵RT反应合成cDNA：吸取100 ng RNA，按照miRNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher公司）操作依次加入5X Reaction Buffer（4 μL）、RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL，1 μL）、10 mM dNTP Mix（2 μL）、RevertAid M-MμlV RT（200 U/μL，1 μL）、miRNA（10 μL）、Primer（2 μL）、Total volume（20 μL），逆转录条件为42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃ 5 min。⑶实时定量PCR：SYBR Green实时定量PCR试剂盒购于美国Genecopoeia公司，引物及探针购自美国abi公司，以U6 snRNA为内参，反应体系：0.1%DEPC水6.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，Power SYBR Green PCR Master 10 μL，基因组DNA模板2μl，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，总体积20 μL。反应条件：预变性（1个循环）95℃ 30 s；扩增（40个循环），变性95℃ 5 s，退火60℃ 35 s；溶解曲线（1个循环），95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，延伸95℃ 15 s；按照2-△△Ct法计算miR-375表达水平。

1.3 随访及资料收集 随访截止时间为2018年8月，收集病人的临床资料及随访资料，包括年龄、性别、病理类型、临床分期、淋巴结转移、脑转移等，随访期间出现死亡即认为预后不良。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，服从正态分布的计量数据以s表示，三组间比较行单因素方差分析，进一步的组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用成组t检验；计数数据以例（%）表示，组间比较行χ2检验，采用受试者工作特征曲线（ROC）评估miR-375诊断NSCLC病人发生脑转移的临床价值，采用逐步回归筛选变量进行多因素COX回归分析，以优势比（OR）和95%置信区间（95%CI）表示各因素对NSCLC病人预后的影响。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miR-375表达水平 转移组和未转移组血清miR-375表达水平均显著低于对照组（P＜0.05），转移组血清miR-375表达水平显著低于未转移组（P＜0.05）。见表1。

2.2 血清miR-375表达水平与NSCLC病人临床病理特征的关系 NSCLC病人血清miR-375表达水平与临床分期、淋巴结转移显著相关（P＜0.05），与病人年龄、病理类型无关（P＞0.05）。见表2。

表1 非小细胞肺癌185例和80例同期健康体检者（对照组）血清miR-375表达水平比较

表2 非小细胞肺癌185例血清miR-375表达水平与临床病理特征的关系/s

表2 非小细胞肺癌185例血清miR-375表达水平与临床病理特征的关系/s

?

2.3 miR-375诊断NSCLC病人发生脑转移的临床价值 ROC曲线分析显示，血清miR-375表达水平诊断NSCLC病人发生脑转移的曲线下面积（AUC）为0.975，灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值、阴性预测值分别为89.74%、94.39%、92.43%、92.11%、92.66%。见图1。

图1 miR-375诊断非小细胞肺癌185例发生脑转移的ROC曲线

2.4 影响NSCLC病人预后的多因素Cox回归分析 多因素Cox回归分析显示，临床分期、脑转移、血清miR-375表达水平是影响NSCLC病人预后的独立危险因素（P＜0.05），其他因素不是影响NSCLC病人预后的重要因素（P＞0.05）。见表3。

表3 影响非小细胞肺癌185例预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

中枢神经系统是NSCLC病人发生转移的常见部位，肿瘤细胞从血管外溢到脑组织，故肿瘤细胞的转移部位常与局部血流量呈正相关，约80%的脑转移发生在大脑半球［6］。诱导性头痛是病人发生脑转移后最主要的临床症状，受机体能量消耗较大、癌细胞侵犯、免疫力下降等因素影响，病人出现体质量下降、疲劳乏力等症状，此外，可能还会出现刺激性咳嗽、呕吐、认知改变、视力障碍、耳鸣、耳聋、语言缺失等临床症状［7-8］。NSCLC病人发生脑转移后神经功能受损，生活质量严重下降，虽然治疗技术在不断的提高，但脑转移病人的生存率仍不理想，因此，早期诊断NSCLC脑转移显得尤为重要［9-10］。外周血检测生物标志物具有方便、快捷、无创、重复性好等优点，是临床中癌症诊断和随访最理想的工具之一［11］。

miRNAs是重要的调控分子，30%哺乳动物的蛋白编码基因可能受miRNAs的调控，miR-375位于人2号染色体q35，cryba2和Ccdc108之间，属于miRNAs家族中的一员，在生物体内具有基因表达调控作用［12-13］。miR-375最早是在胰岛β细胞内被发现的，随着深究的深入，血清miR-375已被证实在胃癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌等病人体内呈低表达，为肿瘤的早期无创性诊断开辟了一条新途径［14］。付婷等［15］研究显示，肝癌组织中miR-375表达水平显著低于癌旁组织，星形胶质细胞升高基因1（AEG-1）是重要的癌基因，是miR-375信号途径下游的直接靶点，miR-375可通过靶向AEG-1抑制肝癌细胞的生长、转移和侵袭。王月秋等［16］阐明多种miRNA参与PI3k/Akt信号通路的调控，推测miR-375可能是PI3k/Akt信号通路重要的调控因子，胰岛素样生长因子1受体（IGFIR1）是其肿瘤抑制作用的新靶点。

目前，国内外关于血清miR-375表达水平与脑转移发病风险关系较少，本研究发现转移组和未转移组血清miR-375表达水平均显著低于对照组，而转移组血清miR-375表达水平显著低于对照组；说明NSCLC病人血清miR-375表达显著失调，miR-375可能是NSCLC病人发生脑转移的预测因子［17］。我们还分析了miR-375与NSCLC病人临床病理特征的关系，NSCLC病人血清miR-375表达水平与临床分期、淋巴结转移显著相关，与病人年龄、病理类型无关，提示血清miR-375低表达可能与NSCLC的疾病进展密切相关。ROC曲线分析显示，血清miR-375表达水平诊断NSCLC病人发生脑转移的AUC为0.975，灵敏度、特异度、准确率均较高，进一步说明血清miR-375表达水平诊断病人发生脑转移的临床价值较高。另外，多因素Cox回归分析显示，临床分期、脑转移、血清miR-375表达水平是影响NSCLC病人预后的独立危险因素，即血清miR-375低表达预示着NSCLC病人预后不良。

综上所述，miR-375在NSCLC中起肿瘤抑制作用，血清miR-375表达水平下调与NSCLC病人发生脑转移有关，可能是诊断NSCLC脑转移及NSCLC病人预后判断的潜在生物标志物，但miR-375的肿瘤抑制机制尚不清楚，我们应进一步研究其临床应用潜力。