微粒在动静脉血栓中作用的研究进展

路文禹，续 薇

(1.吉林大学第一医院 检验科，吉林 长春130021；2.吉林省中医药科学院第一临床医院 检验科)

人体细胞激活或凋亡时会释放一些亚微米级的囊状小泡，微粒是代表这些囊状小泡的一个异质性群体。微粒携带大量细胞表面受体、mRNA 以及生物活性物质，标志着其母细胞的特异性生物功能。其所携带的 miRNAs 和组织因子等穿梭于细胞/组织之间，参与调控血小板活化、止血以及血栓形成等多种病理生理过程。本综述将重点讨论微粒促进或抑制凝血的同时也具有调控纤溶功能的作用，并探讨微粒可能作为新发现的标志在血栓性疾病中的作用。

1 微粒概念

微粒Microparticles(MPS)是一种直径为100-1000 nm的囊泡状结构，最早在1967年由wolf首次发现，称其为血小板尖埃[1]。人类血液中的MPS大多来源于血小板，但也会从白细胞、红细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞中释放，所以在血液中可检测到血小板源性微粒(PDMP)、内皮细胞源性微粒(EDMP)、单核细胞源性微粒(MDMP)等[2]。MPS形成可被细胞活化或细胞凋亡调控，当细胞活化或凋亡被触发后，细胞内钙离子浓度升高，随后细胞骨架发生变化，正常脂质双分子层发生改变，富含负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)由内向外出现翻转，在暴露PS表面同时，MPS可能会从细胞中释放出来[3]。许多研究表明，在变化过程中，钙蛋白酶激活起到重要作用，机制可能是钙蛋白酶有助于限制血小板活化后(PIP)2的形成，而(PIP)2是影响PDMP形成的重要决定因素[3，4]。细胞来源的MP首次被提出的功能就是促凝活性，主要基于其PS暴露和组织因子(tissue factor，TF)的表达[5,6]。另外，MP也可调控炎症、血管生成、肿瘤或免疫反应，并与靶细胞有动态的联系。因此，MP被认为是细胞交流的重要因子[4]。而近来针对MP的研究发现，MP有抗凝功能并参与纤溶反应，进一步补充了MP在血栓中的作用[7]。

2 MP在凝血、血栓、纤溶中的作用

2.1 MP促凝功能

MP的促凝功能主要源于其表达的阴性磷脂，尤其是PS，以及主要的凝血系统细胞激活剂组织因子(TF)。在MP形成时，细胞膜磷脂不对称分布的消失导致PS外翻到膜磷脂双分子层外侧[8，9]。由于带负电荷，PS通过促进MP表面钙依赖凝血因子的组装提高凝血活性，从而促进Xa和凝血酶原酶复合物的形成以及凝血酶的生成[10]。同时携带PS和TF的MP促凝活性最高，经研究发现，携带vWF的EDMP亚群似乎能够诱导血小板聚集。

组织因子(TF)是VII和VIIa的受体，是凝血启动所必需的。组织因子由263个氨基酸残基组成，包括219个氨基酸的N端胞外结构域、23个氨基酸的跨膜结构域和21个残基c端胞质结构域，其中包含与半胱氨酸结合的棕榈酸酯和硬脂酸酯[11，12]。细胞外结构域与细胞因子受体超家族的其他成员是同源的。组织因子结合VIIa因子在细胞表面形成组织因子/VIIa复合物，可激活IX因子和X因子。Jeffrey等科学家通过小鼠动物实验表明，从造血细胞中提取的组织因子在体内血栓形成的初始阶段由微粒传递[13]。

血小板MP是健康人体内最主要的MP，此时表达TF和PS的MP数量很低[14]。血小板MP是否表达TF有争议性，因为血小板MP上TF依赖的促凝活性似乎有限，因此血小板MP对于健康人和患者体内TF+MP的贡献似乎很小[15]。红细胞MP也可能以FXI依赖的方式在镰刀状细胞贫血病或血液制品中促进凝血。体外培养条件下，不同的刺激物，如细胞因子、补体和脂多糖(LPS)可刺激内皮释放携带PS和TF依赖的促凝活性的MP。

2.2 MP抗凝功能

在一定条件下，MPS也具有抗凝血的特性，这与MPS的来源和释放刺激有关。因此，MPS可能有助于调节抗血栓或血栓形成前血管系统之间的平衡。TF:FVIIa复合物受TF途径抑制物(TFPI)的调节[16]。TFPI最初由内皮细胞合成释放到血液中阻止不合理的凝血激活。TFPI本身也被发现存在于不同细胞来源的MP上，如内皮、单核细胞以及急性心梗患者患者体内的循环MP[17，18]。因此，MP表面的TF和TFPI间的平衡影响着它们的促血栓活性，并因不同的疾病而异。另一个调节MP的抗凝机制是其表达的抗凝血受体血栓调节素(TM)和内皮细胞蛋白C受体(EPCR)。血小板MP还发现能通过激活的蛋白C促进Va的灭活。

2.3 MP纤溶功能

在不同类型MPS中发现与纤溶相关物质，这些证据表明MPS是纤维溶解蛋白生成的有效支持物，此发现进一步增强了MPS在调控凝血平衡中的作用[19]。两种丝氨酸蛋白酶，尿激酶(u-PA)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)可激活纤溶酶原生成纤溶酶[20]。u-PA绑定到细胞表面的特定受体(u-PAR)，如单核细胞、T细胞、中性粒细胞、内皮细胞和成纤维细胞；t-PA主要绑定到神经元、突触细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。MP依赖的纤溶酶生成机制包括经典的机制，即纤溶酶原结合MP表面的纤溶酶原激活剂，以及新发现的机制，即MP锚定的u-PA直接激活绑定在血小板、纤维蛋白或细胞外基质蛋白上的纤溶酶原[21]。这些发现表明，MP可作为纤溶酶生成的有效表面。纤溶酶生成受到纤溶酶原激活剂和抑制剂的高度调控。内皮MP上可检测到t-PA和它的抑制物PAI-1形成的复合物，这在纯化的内皮MP和血栓性血小板减少性紫癜患者体内纯化的MP上均可发现。这些发现表明MP作为载体可携带多种纤溶酶或其抑制物，从而发挥调控凝血平衡的作用。

3 MP在血栓性疾病中的标志物作用

研究发现在多种动静脉血栓性疾病中循环MP水平均升高，且与疾病的病理生理发生发展过程有关[22]。循环MP检测的临床意义可看作是MP产生和清除的动态平衡[23]。尽管MP因高度促凝参与疾病的恶化过程，但至今仍不清楚MP是心血管疾病的原因还是病理过程的结果，或仅仅只是患心血管病危险因素增大的标志。因此，本部分将着重阐述近期研究成果，并从中发现一些证据证实MP可能作为血栓性疾病标志物的相关研究成果。

3.1 动脉血栓

多种危险因素与心脑血管事件相关，Nicolas Amabile通过对844名没有心血管疾病(心肌梗死史、冠状动脉供血不足、中风和心力衰竭)的参考者进行分组(以性别、年龄、体重指数等)分析，通过Guava EasyCyte8 HT进行分析表明，CD144阳性单核细胞微粒血浆水平与几个心血管危险因素有关，包括较高的甘油三酯水平、高血压和代谢综合征，可能原因是高代谢危险因素导致内皮细胞活化或损伤增加[24]，也可能是病理情况下这些增多的MP未被及时清理。进一步发现，MP可促进单核细胞黏附于血管内皮细胞[25]，这是后续多种炎症细胞浸润以及粥样斑块形成的关键步骤。Felix Jansen 等科学家通过对人冠状动脉内皮细胞培养和小鼠模型进一步研究了相关机制：循环MP促使血管内皮细胞表达粘附分子ICAM-1，并刺激单核细胞表达CD11a等粘附分子受体，MP亦可通过携带的miR-222调控ICAM-1的表达[26]。更重要的是，研究发现从患者粥样斑块分离出来的MP可直接将有功能的ICAM-1转移至靶细胞。并且血小板MP可将促斑块形成的趋化因子CCL5携带至血管内皮细胞，从而促进白细胞在血管内皮的粘附[27]，Stephen 等使用HL-60细胞，转染表达人P选择素，发现在湍流的血液中血小板MP携带的P-selectin则可通过促进白细胞-白细胞相互作用助力单核细胞穿透内皮屏障进入内皮下[28]。这些基础研究表明，病理情况下释放的MP可影响内皮下空间中白细胞功能及其分布，促进斑块形成和发展，从而促进血栓的形成。在临床研究中发现，短暂性缺血性中风和冠心病患者循环血小板MP的水平增高，并且增高的血小板MP与健康男性冠心病的高风险相关[29]。Voukalis等[30]取200例经血管造影证实为CAD患者，排除了恶性疾病、炎症性疾病和除心肌缺血外的严重急性缺血患者，取血浆标本使用FACSCalibur流式细胞仪染色后进行分析，证实循环CD31+/Annexin V+MPs水平是稳定型冠心病患者心血管事件的独立预测因子。Neves等[31],招募了42名肿瘤患者，应用VEGFi进行治疗(VEGFi是一种抗血管生成药物，用于治疗实体肿瘤)比较用药前后的MPs变化情况，从最终取得的39例数据中得出，应用VEGFi会导致血管内皮损伤，而由此释放出来的MPs，是内皮细胞损伤的潜在标志物。Mörtberg等[32]也证明，在晚期肾衰患者中，内皮MP显著增高，其水平是一个预测严重心血管结局的有效标志物。此外，MP依赖的TF活性在急性冠脉综合症患者中升高，血管成形术后更高，并在溶栓失败时依然增高。这表明溶栓失败可能会导致循环TF+MP整合到血栓中。尽管多项研究表明众多血栓性疾病中血小板或白细胞MP水平增高，进一步研究需要测定出血小板和白细胞MP在预测未来血栓性事件的阈值。

3.2 静脉血栓

大部分有关MP和静脉血栓(VTE)的研究集中于癌症患者和癌症模型小鼠，因为肿瘤细胞在体外释放大量的TF+MP。鉴于这些MP表达大量的TF，Anubha等研究117名患有包括胰腺疾病、肺栓塞、深静脉血栓和其它动、静脉疾病的患者，对这些患者进行MP-TF的连续监测，平均随访时间为421天，所有患者MP-TF平均和中位活性分别为2.15±3.8和1.2 pg/ml，在胰腺癌中MP-TF>2.5 pg/ml的中位生存期为98.5天，得知MP-TF活性升高与胰胆管癌和血栓栓塞患者生存率下降有关[33]。Christensen等研究发现，癌症患者癌组织中TF表达增加提示预后差[34,35]。Lacroix等[36]在小鼠原位癌模型中测定了肿瘤来源的TF在血栓形成中的作用。研究者将携带有活化人源性TF的人胰腺癌细胞种植于裸鼠，发现凝血瀑布的激活是由于小鼠体内人源的TF导致的。然而只有不到5%的TF活性与循环MP有关。这些结果表明凝血瀑布的系统性激活所涉及的TF主要是肿瘤本身。这项研究反应了癌症相关的动静脉血栓形成的复杂性。研究中涉及的癌症细胞系、MP的检测和定义方法、肿瘤的定位，以及在野生型或裸鼠体内用到的人源或鼠源细胞系均会影响疾病的病理生理。然而，重要的是癌细胞MP可能并不是导致促凝状态发展到癌症相关血栓形成的唯一因素。

事实上，单核MP或癌细胞MP似乎通过携带的活化TF直接参与血栓形成，但增多的血小板MP或内皮MP可能也反映出体内高凝状态。进一步的研究需要证实不同亚群的MP在动静脉血栓中的作用。

4 应用和展望

尽管心血管疾病的诊治已得到一系列的进展，血栓性疾病仍然是发展中国家致死率和致残率的主要原因[37，38]。流行病学研究发现，随着危险因素在全球范围内的不断升高，针对危险因素的治疗并不能消除心血管疾病的风险[39]。因此，发现新的标志物和潜在治疗方法至关重要。

在2型糖尿病合并代谢综合症和微血管并发症患者中，血小板源性MPS增加以及在与血栓栓塞并发症相关的疾病中，包括DIC、肝素诱导的血小板减少、动脉粥样硬化性血管疾病会出现MP数量增加。体个动物试验也证明，造血细胞来源的组织因子在血栓形成过程中的积累与微粒有关，微粒在血栓形成的初始阶段起到传递作用。目前对微粒进行检测最常用的是基本光散射的流式细胞术，可以确定微粒大小和数目，但针对MP的研究仍然处于初级阶段并受到诸多方面的限制。首先，MP和其他类型的囊泡结构大小接近，且在磷脂含量和抗原成分方面的异质性不是很明显，如何以可重复性的方法去定义和检测MP成为比较棘手的问题。其次，对于定义稀有MP亚群，迄今并没有最佳的一致性标志物。最后，我们必须意识到MP仅反应患者血管状态的一个方面，并不能除外MP母细胞所做的贡献。对于未来MP的研究，最好使用更具兼容性的检测系统，这将为评估血栓事件的发生风险以及提高检测治疗手段的有效性提供更好的前景。