Rho蛋白调控血小板细胞骨架重排的分子机制研究进展

杨 颖,田文沁

(北京大学人民医院 输血科，北京100044)

血小板是血液循环中体积较小的无核细胞，由骨髓中的巨核细胞产生，其在止血和血栓形成的过程中发挥了重要的作用[1]。当血管发生损伤时，血小板能够黏附于受损的血管内皮，并形成血栓，进而发挥止血的作用[2]。然而，血小板的过度活化可以导致血栓性疾病的发生[3]。血小板在活化的过程中会发生细胞骨架的重排，进而引起其形态变化、颗粒分泌以及聚集等一系列改变。骨架相关分子参与调控血小板细胞骨架重排，这其中就包括Rho蛋白[4]。本文拟对Rho蛋白调控血小板细胞骨架重排的分子机制研究进展进行综述。

1 Rho蛋白的概述

Rho蛋白是一组相对分子质量为20-25 kD的三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，因其具有GTP酶活性，又被称为Rho GTP酶，Rho GTP酶在调控细胞骨架重排方面发挥重要的作用。已知的Rho蛋白家族有20余个成员，根据其结构和功能不同，可分为Rho亚家族、Rac亚家族、Cdc42亚家族、Rnd亚家族、Rho BTB亚家族等[5,6]。其中，Cdc42、Rac1和RhoA是目前研究最多的Rho蛋白。Rho蛋白是一种开关蛋白，包括无活性的GDP结合的形式以及有活性的GTP结合的形式，这二者之间在Rho蛋白调控分子的调控下可以相互转换[7]。活化的Rho蛋白即GTP结合的Rho蛋白可以与下游的效应分子结合，发挥调控细胞骨架重排、细胞迁移运动等作用[8]。研究表明，Rho蛋白家族的Cdc42、Rac1和RhoA在血小板中均有表达，它们在血小板收缩、伪足形成以及颗粒分泌等发面发挥了重要的调控作用[9-11]。

2 Rho蛋白在血小板中的调控作用

2.1 RhoA调控血小板收缩并维持血栓稳定性

当血小板激活剂如凝血酶、血栓烷类似物等与血小板表面膜受体结合后，可以使血小板活化。活化的血小板其膜受体可以发生一系列分子结构的改变，其中Gα13亚基可以激活p115RhoGEF，进而使RhoA活化。活化的RhoA可以激活其下游效应分子Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK)，活化的ROCK可以增强肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，进而促进肌球蛋白收缩[12]。同时，活化的RhoA 还可以激活另一个重要的下游效应分子mDia(Mammalian Diaphanous related protein，mDia)，活化的mDia分子可以促进肌动蛋白丝的延伸和成核，进而在血小板内形成新的应力纤维，促进血小板的收缩和迁移运动[13]。

整合素受体在RhoA对血小板的调控过程中也发挥了重要的作用。血小板活化后，Gα13亚基在激活RhoA的同时，可以与血小板膜表面的整合素受体αⅡbβ3的胞内段β3亚基结合，进而促进Src激酶的活化，活化的Src激酶可以激活p190RhoGAP，从而使GTP水解，导致RhoA失活。随后，血小板胞内的钙信号通路被激活，钙调蛋白可以将整合素受体αⅡbβ3的胞内段的β3亚基剪切掉，从而抑制Src激酶的活性，使失活的RhoA恢复活性形式[14]。RhoA的这一变化过程，在促进血小板的收缩、促进血块的弹性回缩以及维持血栓稳定性的过程中发挥了重要的作用。研究表明，RhoA缺陷的小鼠，其血小板的收缩能力减弱、血栓形成能力减弱以及鼠尾出血时间延长[11,15]。

2.2 Cdc42促进血小板丝状伪足的形成并调控其颗粒分泌

Cdc42高表达于血小板中，当凝血酶、ADP等激活剂使血小板活化后，Cdc42聚集于血小板细胞骨架区域，通过与下游效应分子结合，促进血小板表面丝状伪足的形成并参与调控血小板的颗粒分泌。丝状伪足有助于血小板确定细胞迁移的方向，颗粒分泌可以促进血小板聚集[16,17]。在真核细胞中，活化的Cdc42激活Wiskott Aldrich综合征蛋白家族(Wiskott Aldrich syndrome protein，WASP)，进而激活肌动蛋白相关(actin related protein 2/3，Arp2/3)复合体，促进肌动蛋白单体组装成肌动蛋白丝，进而促进丝状伪足的形成[6]。然而，有研究表明，将Cdc42条件性敲除或者在体系中加入Cdc42的抑制剂，细胞同样可以形成丝状伪足。这也提示了，体系中可能存在与Cdc42功能类似的其他Rho蛋白[18,19]。在血小板中Cdc42调控丝状伪足形成的机制也并不是完全清楚，但是研究表明，Cdc42缺陷的血小板，其丝状伪足的形成能力减弱，血小板颗粒分泌异常，这也证明了Cdc42在调控血小板功能方面发挥了重要的最用[16]。

2.3 Rac1促进血小板板状伪足的形成

Rac亚家族包括Rac1、Rac2和Rac3三个成员，其中Rac1和Rac2表达于血小板中，Rac1在血小板中发挥了重要的调控作用，Rac2在血小板中的作用并不清楚[20]。与Cdc42类似，当凝血酶、胶原等激活剂使血小板活化后，Rac1也聚集于血小板细胞骨架区域，诱导血小板表面质膜突起，形成板状伪足。板状伪足可以促进血小板与周围基质形成粘附连接，并形成迁移运动时的锚定位点。在血小板中，活化的Rac1激动其下游效应分子WASP家族富含脯氨酸同源蛋白(WASP family verprolin homologous protein，WAVE)，随后激活Arp2/3复合体，促进肌动蛋白丝的形成，进而在血小板膜表面形成肌动蛋白丝丰富的板状伪足[21]。研究表明，Rac1缺陷的血小板，其板状伪足的形成能力减弱，血小板聚集能力减弱[10]。

3 Rho蛋白的调控分子在血小板中的作用

如前所述，Rho蛋白是一种开关蛋白，活化的Rho蛋白和非活化的Rho蛋白可以在鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchanging factors，GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)和GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)等分子的调控下相互转换[22]。

3.1 GEFs对血小板中Rho蛋白的正向调控作用

GEFs催化Rho蛋白的GDP的释放，促进Rho蛋白与GTP结合，从而使Rho蛋白活化。现已知有60余种GEFs参与调控Rho蛋白的活性。不同的GEFs具有相似的功能结构域，它们都包含1个DH(Dbl homology domain)结构域和1个PH(pleckstrin homologyv domain)结构域，前者与Rho蛋白结合并参与催化其构象的改变，后者参与GEFs在胞膜上定位功能。然而，仅有很少数的GEFs参与调控血小板中的Rho蛋白[23]。如前所述，p115RhoGEF可以被Gα13亚基激活，进而活化RhoA，进而在血小板内形成新的应力纤维，促进血小板的收缩和迁移运动。除此之外，Vav蛋白是血小板中Rac特异性的GEFs。Vav蛋白家族包括三个成员，分别是Vav1、Vav2和Vav3。血小板活化后，Vav1被激活，促进Rac与GTP结合，活化的Rac可以促进血小板板状伪足的形成[24,25]。目前，在血小板中并没有发现Cdc42特异性的GEFs。

3.2 GAPs对血小板中Rho蛋白的负向调控作用

GAPs促进Rho蛋白GTP的水解，加速其与GDP结合，将Rho蛋白由活性状态变为无活性状态。目前已经发现70余种GAPs参与调控Rho蛋白的活性，然而GAPs在血小板中的调控机制并不完全清楚[26]。已知p190RhoGAP可以使血小板中RhoA失活，在血小板的收缩、血块的弹性回缩的过程中发挥重要的调控作用。有研究发现，凝血酶激活的血小板中，IQGAP2参与了血小板丝状伪足的形成，IQGAP2属于IQGAPs家族，这个家族的成员虽然有GAPs相关结构域，但是其对Rho蛋白发挥的是正向调控作用。IQGAP2参与血小板丝状伪足形成作用机制有待于进一步探讨[27]。

3.3 GDIs对血小板的调控作用

GDIs可以捕获GDP结合的Rho蛋白，阻碍GDP从Rho蛋白上分离，从而抑制Rho蛋白的活性，并且阻碍Rho蛋白的胞内转位[28]。目前已发现四种作用于血小板的GDIs。蛋白组学研究表明，GDIsα在血小板中高表达，其作用机理并不清楚[29]。GDIs在血小板中的作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，Rho蛋白及其调控分子在血小板细胞骨架重排方面发挥了至关重要的调控作用，参与了血小板收缩、血小板伪足形成以及血小板颗粒分泌等重要过程。目前我们对于Rho蛋白在血小板中的作用机制并不完全清楚，随着研究技术的不断进步，将会发现新的调控途径以及靶分子，并探究各种调控机制之间的联系和制约。同时，积极探索Rho蛋白在不同血小板相关疾病中其调控方式和调控途径的相关联系。相信随着研究的不断深入，Rho蛋白能够成为血小板相关疾病预防和治疗的新靶点。