DREB转录因子研究进展及其在甘蔗抗逆育种中的应用

（云南农业大学甘蔗研究所，昆明 650201）

0 引言

植物在生长发育过程中往往会受到周围环境中的一些生物和非生因素的影响。而在长期的生物进化过程中，植物早已经形成了抵御逆境胁迫的应答机制，以适应多变的环境条件。相关的研究表明：植物的这些逆境胁迫调控机制分别是在基因转录水平和蛋白翻译、加工水平上进行调控的[1]。在这些调控机制中，转录因子起到主导性的作用。转录因子位于植物信号传导通路中的倒数第二步，在逆境胁迫下转录因子能激活或抑制防御基因的表达，以及调节不同信号通路之间的相互作用[2]。

有关转录因子的研究在拟南芥中较为广泛，Riechmann 等在拟南芥中鉴定出1 500 个转录因子，包括NAC、b-ZIP、Myb/c、WRKY和AP2/ERF家族，其中研究较为完善的是AP2/ERF家族[3]。DREB(Dehy-dration responsive element-binding protein)转录因子，即脱水应答元件结合蛋白，属于AP2/ERF家族基因，在植物对逆境胁迫的应答调控中扮演着重要的角色[4]。相关研究表明：植物受到逆境胁迫的诱导后，会促使DREB基因表达产生DREB 蛋白（反式作用因子），接着DREB 反式作用因子进一步作用于下游靶基因启动子的CRT/DRE顺式作用元件（核心序列为A/GCCGAC）上，从而调控靶基因的表达对逆境胁迫做出应答[2,5-6]。

对于DREB基因家族的研究，Shinozaki-Yamaguchi 等1994 年首次在拟南芥中发现rd29A 启动子上的DRE顺式作用元件[7]，接着Liu等在拟南芥中鉴定得到DREB1和DREB2两个基因，且分别受低温和干旱胁迫诱导[8]。目前，对于DREB基因的研究在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[9]、水稻（Oryza sativaL.）[10]、小麦（Triticum aestivumL.）[11]等植物中较为广泛。

DREB基因作为植物特有的一类转录因子，在植物的生长发育过程中参与了多种调控功能，包括生物胁迫调控、非生物胁迫调控、生物合成调控和果实成熟调控等[12-13]。因此，研究DREB家族基因对进一步认识植物抗逆机制，指导转基因抗逆育种具有重大的意义。然而，在甘蔗及近缘野生种内关于DREB基因的研究不多，因此加强该方面的研究与探索，将有利于甘蔗抗逆品种（系）的选育。

1 植物DREB基因的结构及其转录因子

1.1 DREB基因的结构

植物DREB家族基因具有典型的AP2/ERF 保守结构域，保守结构域是一个具有多种生物学功能的保守氨基酸序列，可参与转录活性、蛋白质相互作用和核定位[14]，由60～70 个氨基酸组成[6]，编码蛋白主要以α 螺旋及β 折叠为主[15-16]。Dossa 等在芝麻全基因组的基础上，对DREB家族基因进行鉴定，发现芝麻中DREB基因占全基因组的0.55%；对DREB基因进行内含子和外显子分析，发现70%的DREB家族基因没有内含子，基因呈现线性表达的趋势[17]。同样的，姚艳丽等在割手密（Saccharum spontaneumL.）中克隆得到两个割手密SsDREB2基因，发现两个基因均只有一个内含子，且两个基因序列的相似度为96.6%，只存在3个氨基酸位点的差异[18]。这些结果表明DREB家族基因在进化中存在着结构上的保守性。Sakuma 等研究发现，拟南芥AtDREB2A基因转录本的C 端存在一个含有脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸结合而成的信号肽，正常条件下，信号肽的存在AtDREB2A蛋白会降解不能激活下游基因的表达。当逆境胁迫时信号肽被选择性剪切，使得AtDREB2A蛋白能结合在下游靶基因启动子上，并进一步激活靶基因表达[19]。

1.2 DREB转录因子家族的分类

AP2/ERF转录因子家族数目庞大，根据氨基酸序列相似性和保守结构域数目分类[10,17]，把AP2/ERF家族分为AP2、ERF、DREB、RAV和其他5个亚族，其中DREB亚族和ERF亚族只编码一个AP2 保守结构域，RAV亚组基因编码单个AP2和B3 结构域，AP2亚组基因编码2 个完整的AP2 结构域[4,6,10,17]。目前，在拟南芥中鉴定出56个DREB亚家族成员，划分为A1～A6[19]。Sharoni等在水稻全基因组范围鉴定到163个AP2/ERF家族基因在12 条染色体上随机分布，其中DREB亚组基因有57 个[10]。在咖啡豆中有31 个DREB家族基因，可分为4 个亚组[20]。在芝麻中鉴定到41 个DREB基因[17]。鉴定出中国枣分布于9 条染色体上的共25 个ZjDREB基因；系统进化分析表明：ZjDREB蛋白可分为5 个亚组(A1～A5)，但缺乏与拟南芥AtDREB相对应的A6 亚组[14]。田文等在普通小麦DREB基因家族的全基因组鉴定及热胁迫下表达模式分析的研究中得到204 个TaDREB基因，可分为6个亚族（Ⅰ～Ⅵ）；对204个DREB基因进行启动子顺式作用元件分析，结果发现95个顺式作用元件，他们分别和干旱、低温、高温胁迫和光响应有关[11]。

2 植物DREB转录因子调控的信号通路

2.1 依赖ABA途径

脱落酸（ABA）是逆境激素，一些DREB基因的转录也受到ABA 的调控[4]。相关研究发现：在ABA 胁迫下，咖啡豆CcDREB1D转录因子在顶芽和叶的保卫细胞中表达上调[20]。Upadhyay等研究发现：番茄SlDREB3基因在烟草中的异位过表达能抑制烟草内源ABA 的产生，同时对外源ABA 的敏感性也降低，表现为转基因株系光合速率增加、种子萌发率提高、水分胁迫下种子产量提高和根系生长较旺[21]。Kudo 等研究过表达DREB1A基因拟南芥的转录水平，发现DREB1A基因的下游与次生代谢（12.7%）、应激（11.7%)、激素代谢（6.4%）、糖代谢（4.5%）有关的基因能被ABA、低温、干旱、渗透和盐胁迫诱导上调表达[9]。而在整个逆境信号通路中，DREB基因位于倒数第二位[2]。在逆境胁迫下，水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）、脱落酸（ABA）等信号通路相关的磷蛋白信号被激活，并传递到细胞核激发DREB转录因子的表达；DREB基因表达后，会进一步结合于SA、JA、ET、ABA 等合成通路相关靶基因启动子的CRT/DRE 顺式作用元件（核心序列为A/GCCGAC）上，从而进一步启动靶基因的表达对胁迫做出应答[2,5-6]；产生的ABA、SA 和JA 等小分子物质也会正反馈DREB1基因的表达[2,20]。

2.2 不依赖ABA途径

DREB基因作为反式作用因子，功能的实现是通过逆境调控和多基因相互作用来实现的[2]。因此，胁迫诱导DREB基因表达后，DREB蛋白上的AP2保守结构域会特异性地结合于抗冻蛋白、跨膜转运蛋白、水通道蛋白和渗透调节物质合成酶等功能蛋白基因的启动子上，启动功能基因的表达[22]。而DREB转录因子的表达也被特定的转录因子所调控，Chinnusamy等研究发现，拟南芥ICE1（Induce of CBF expression 1）转录因子能结合到DREB基因的启动子上，并且正调控DREB基因的表达[23]。Yong 等研究发现百合LlNAC2基因启动子上存在与百合LlDREB1基因AP2 结构域结合的顺式作用元件[24]。同样，在转大豆GmDREB1A;2和GmDREB1B;1基因的拟南芥植株中，下游AtCOR47抗冻靶基因的表达明显提高[25]。为此可以推测这些相互作用的基因包括：调控DREB基因表达的上游转录因子、DREB基因和DREB基因进一步调控的下游靶基因[2,24]。也有研究表明：植物对逆境胁迫的应答反应，与DREB基因启动子甲基化和组蛋白修饰有关。Song等研究发现高盐胁迫导致大豆AP2/DREB家族Gm20g30840和Gm16g27950基因启动子区域去甲基化，使得这两个基因的表达量增加，而Gm20g30840的组蛋白H3K4me3 和H3K9ac 水平上升，H3K9me2 水平下降，Glyma16g27950的组蛋白H3K9me2、H3K4me3和H3K9ac没有变化[26]。然而，DREB蛋白功能的实现也需要进一步的磷酸化作用[4]。钱禛锋等分析被低温胁迫诱导表达的蔗茅ErDREB1A蛋白的结构，发现该蛋白具有多个磷酸化位点[26]。最终，功能基因的表达会增加细胞中的抗氧化酶活性和渗透调节物质，消除细胞中的活性氧和自由基，提高细胞渗透势，从而减少胁迫造成的伤害[9,12]。

3 植物DREB基因的功能

3.1 DREB基因参与非生物胁迫的应答

3.1.1DREB基因参与低温胁迫的应答

低温是影响植物生长发育的重要生态因子。相关研究表明：植物对低温胁迫的应答反应与DREB基因转录水平和DREB 蛋白的结构有关[4]。Yuji 等研究发现低温胁迫可以诱导大豆营养器官中CBF家族转录本短暂的迅速积累，转大豆GmDREB1A;2和GmDREB1B;1基因拟南芥植株的耐寒性显著提高，下游AtCOR47抗冻靶基因和锌指蛋白转录因子SCOF-1基因的表达也大幅度提高；并且另外的一些启动子上不具备DRE顺式作用元件的脱水素基因Glyma17g24193和Glyma16g04190也出现上调表达[25]。Feng 等在结缕草中克隆得到具有一个AP2结构域ZjDREB1.4基因，该基因和下游启动子元件的酵母单杂交结合活性分析表明：该基因可以和下游靶基因启动子上的多个顺式作用元件结合，其中对GCCGAC 的结合活性强于ACCGAC。并且，结缕草ZjDREB1.4基因在拟南芥中的过表达，转基因植株表现出较强的耐寒性[28]。同样，甜樱桃DREB1基因在拟南芥中表达，能显著提高拟南芥的耐寒性[29]。Donde 等研究发现：DREB1A基因能显著提高水稻的耐寒性，这与低温胁迫时DREB1A基因编码蛋白上的α 螺旋随机运动和β 折叠的破坏有关，使得AP2 结构域与靶基因启动子上的A/GCCGAC顺式作用元件结合活性增强[16]。

3.1.2DREB基因被干旱胁迫诱导表达

DREB基因的表达也受到干旱胁迫的诱导。Liu 等在拟南芥中最早鉴定出被干旱胁迫诱导表达的DREB2基因[8]。目前，随着基因组测序、转录组测序和分子克隆的不断发展，已经在多种植物中克隆出被干旱胁迫诱导表达的DREB家族基因。Dossa 等对芝麻全基因组和干旱胁迫下的DREB家族转录本分析，发现几乎所有的DREB家族基因都被干旱胁迫诱导表达[17]。拟南芥AtDREB1C基因在水稻中的过表达，显著提高水稻在干旱胁迫下的生长势和植株干重，说明AtDREB1C基因可被干旱胁迫所诱导表达，且能进一步激活水稻细胞伸长和有机物合成及积累相关基因的表达[30]。同样，咖啡豆CcDREB1D基因也是可被干旱胁迫诱导上调表达的基因[20]。这些研究表明了DREB基因在植物抵御干旱胁迫的反应中扮演着重要的角色。

3.1.3DREB基因参与其他非生物胁迫的调控

目前，相关的研究已经表明：DREB家族基因还广泛参与了植物的抗高盐、重金属[31]和渗透胁迫调控[4]。Li等克隆到沙漠苔藓ScDREB10基因，并进一步在拟南芥中过表达发现：ScDREB10基因在拟南芥中过表达，能激活下游胁迫相关基因的表达和参与活性氧清除系统，从而能提高渗透和盐胁迫下拟南芥种子的发芽率[32]。同样，盐胁迫下，番茄SlDREB1蛋白通过AP2/ERF结构域侧翼上的KYRG保守域与脱水反应元件DNA结合，参与乙烯介导的信号通路、转录启动和防御反应[33]。在重金属镉处理下，蓖麻叶片喷施钼，DREB基因的表达量明显上调。并且，DREB基因的表达和游离脯氨酸及酚类物质等生理活性物质的含量成正相关[31]。

3.2 DREB基因参与植物对生物胁迫的应答

DREB家族基因除了参与植物的非生物胁迫调控外，还参与植物的病害防御调控。Sharoni等对水稻接种水稻条纹病毒（RSV）、水稻调谐球形病毒（RTSV）和水稻矮缩病毒（RDV），发现在接种病毒后，AP2/ERF家族基因发生差异表达，其中，接种RTSV 和RDV诱导DREB基因上调表达更显著[10]。同样，Charfeddine等研究发现：马铃薯StDREB1基因与马铃薯的抗病性有关，当转StDREB1基因马铃薯感染茄镰刀菌（Fusarium solani）后，StDREB1基因的表达量明显提高，且转基因马铃薯的抗病性也高于对照[34]。对于DREB基因调控病害防御的机理目前尚未清楚。推测，这可能与病害胁迫下，DREB基因参与调控了过氧化氢等活性氧的产生系统，促使植物体内产生活性氧，从而抵抗病菌的侵染。

4 DREB基因在甘蔗及其近缘野生种中的研究

DREB基因作为植物特有的一类转录因子，在植物的逆境胁迫应答反应中具有重要的作用。目前，在拟南芥、水稻、小麦等植物中都进行了全基因组的深入研究。在甘蔗及其近缘野生种中的研究：李春瑶研究表明甘蔗SoDREB2基因在烟草中表达能提高烟草的抗旱性[35]。曹哲群等通过分析蔗茅低温胁迫下的各项生理指标表明蔗茅具有较强的耐寒性[36]。接着钱禛锋等在蔗茅中克隆出被低温胁迫诱导上调表达的蔗茅ErDREB1A基因[26]。在割手密中，姚艳丽等克隆得到两个割手密SsDREB2基因[18]。徐荣等探讨了植物的抗旱性属于多基因控制的数量遗传性状，可以通过多基因共转化来提高甘蔗的抗旱性，并且进一步克隆、构建了割手密ScNAC1和ScDREB融合基因表达载体[37-38]。对于转DREB基因甘蔗的研究：Malhotra 等通过基因枪法把DREB1A基因转入甘蔗，通过对转基因苗干旱、低温和盐胁迫分析表明：DREB1A基因被干旱、低温和盐胁迫诱导上调表达，具有抗旱、耐寒和耐盐的功能[39]。Rafaela 等通过基因枪法转化拟南芥AtDREB2A CA基因在甘蔗中过表达，提高了转基因甘蔗的抗旱性，和对照相比，干旱胁迫下，转基因甘蔗植株具有较高的相对含水量和蔗糖含量，并且转基因甘蔗中半乳糖合酶基因和甘蔗干旱应答SCDR2/4基因的表达也被上调[40]。因此认为该基因对糖代谢相关的一些通路具有调控作用。吴杨通过基因枪法把斑茅EaDREB2B基因转入甘蔗，提高了转基因甘蔗的抗旱性[41]。施肖堃进一步研究表明：斑茅EaDREB2B基因过表达能增加甘蔗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）含量，从而清除干旱胁迫产生的活性氧，减少膜脂氧化作用[42]。并且EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T1代中能稳定遗传[413]。Sruthy等农杆菌介导转化斑茅EaDREB2基因在甘蔗中过量表达，提高了转基因甘蔗细胞膜热稳定性和相对含水量，维持了较高的气体交换参数、叶绿素含量和光合效率，从而增强了转基因甘蔗抗旱性和耐盐性[44]。那么，是否DREB转录因子调控着膜稳定蛋白、叶绿素合成和光合作用相关基因的表达，这需要进一步的研究去证明。

5 DREB基因应用于甘蔗抗逆育种的思考

5.1 甘蔗转基因育种的优势及其目前存在的问题

甘蔗属于喜大水大肥的热带、亚热带作物。然而，在我国蔗区以旱坡地为主，水分、温度和光照等对甘蔗的产量和品质有一定的限制作用。因此，从育种的角度出发，育成抗逆性、适应性强的甘蔗品种是甘蔗育种主要的目标。甘蔗传统育种方法以有性杂交育种为主。然而，传统的杂交育种具有远缘杂交不亲和、育种年限长等缺陷。目前，随着转基因技术的不断发展，转基因育种已成为一种重要的辅助育种手段。在生产上以不开花的甘蔗品种为主，同时加工产品以蔗糖为主，在转基因安全方面具有一定的天然优势。因此，转基因技术运用到定向改良甘蔗遗传性状上具有较好的应用前景。但是，目前甘蔗抗逆转基因研究方面仍面临着极大的挑战：候选基因的缺乏、遗传转化效率低等问题，这使得转基因技术在甘蔗上的应用受到极大的阻碍。

5.2 蔗茅DREB基因在转基因甘蔗培育上的潜在价值

DREB家族基因是公认的植物特有的一类转录因子，广泛参与了植物在逆境胁迫下的应答调节机制。并且，相关研究表明DREB基因在结构上具有保守性[34，43]和遗传上具有稳定性[44]，这使得对家族基因的研究较为容易，同时也有利于保持转基因株系在遗传上的稳定性。目前，有关DREB家族转录因子的研究，大多数只是涉及在转录组和全基因组基础上的分子克隆和功能研究。在甘蔗及其近缘野生种中对DREB基因的研究相对较少。在甘蔗新品种培育和繁殖上更是没有转DREB基因甘蔗的推广。蔗茅（Erianthus fulvusNess.）是甘蔗属（Saccharum）近缘的蔗茅属（Erianthus）内的一个野生种，具有耐寒、抗旱、耐贫瘠、宿根性强、抗锈病等优异特性[36，45]。因此，在杂交育种中，蔗茅也常是优良抗逆基因的来源。目前我们已成功地在蔗茅中克隆得到能被低温胁迫诱导上调表达的ErDREB1A基因[34]。所以，结合蔗茅本身的优异特性，研究、挖掘蔗茅野生种中抗逆相关DREB基因，通过转基因手段，培育出抗逆性强的转蔗茅DREB基因甘蔗新品系，是改良甘蔗抗逆性能的可期手段。

6 展望

尽管大量的研究已经表明DREB基因在植物抵抗逆境胁迫中扮演着重要的角色，然而，对DREB基因具体调控抗逆的机理仍然需要进一步的研究和发现。随着分子克隆和转基因技术的不断发展，转基因技术可成为今后实现作物遗传性状定向改良的技术手段。尤其对于甘蔗生产而言，水分、温度和光照等限制因素使得培育抗逆性强的甘蔗新品种（系）成为了主要的育种目标。因此，结合甘蔗野生种的优良抗逆特性和DREB基因具有的抗逆调控功能，充分挖掘野生种中的DREB基因，可为解决候选基因缺乏的问题提供更多可行思路。结合转基因技术，通过建立高效的遗传转化体系，培育出抗逆性强的转DREB基因甘蔗新品种（系），可以有效地推动甘蔗良种改良进程。在今后的甘蔗抗逆育种中，培育抗逆性强的转DREB基因甘蔗值得关注。