甘蔗赤腐病菌变异及甘蔗抗病性研究进展

李婕，张荣跃，王晓燕，单红丽，尹炯，罗志明，仓晓燕，黄应昆

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699）

0 引言

甘蔗（Saccharum officinarumL.）是重要的糖料作物之一，而甘蔗赤腐病是甘蔗上最严重的真菌病害之一，主要危害蔗茎（即蔗茎赤腐病）和叶片中脉（即中脉赤腐病）。严重危害时可导致甘蔗减产29.1%以及蔗糖分损失30.8%以上[1]，严重影响甘蔗产量和品质。甘蔗赤腐病在中国各蔗区均有发生，近年来，由于甘蔗连作、气候多变、高湿多雨及多种病虫害混合发生等因素，为甘蔗赤腐病的发生流行提供了有利条件，部分蔗区甘蔗赤腐病危害严重，已由次要病害上升为主要病害。目前生产上无高抗品种，加上药剂防控效果不理想，甘蔗赤腐病菌变异频繁，以及长期种植单一感病品种等原因，常造成抗病品种“丧失”抗性而成为感病品种。

甘蔗赤腐病病原菌无性阶段为刺盘孢属的镰孢炭疽菌（Colletotrichum falcatumWent）[2]，该菌分生孢子的致死温度较高（60℃、10 min）[3]，因此种苗温水处理不能有效杀死蔗种中携带的赤腐病菌，不过，实践证明，在甘蔗种植之前选用合适的药剂对种茎进行消毒，是减少该病发生的有效途径之一[4]。然而明确该病的发病及抗性机理，对病原菌变异及品种抗病性进行深入研究才是病害可持续防控的必由之路，因此本文结合国内外最新研究进展，对甘蔗赤腐病菌变异、分子检测方法及甘蔗抗赤腐病研究进行了综述，以期为我国甘蔗赤腐病的研究和防控提供重要理论依据。

1 甘蔗赤腐病菌变异

甘蔗赤腐病菌极易发生变异，目前在形态变异、致病性变异及分子变异方面已有大量研究。研究推断多数菌株形态分类与致病性变异呈正相关，而分子多样性无此关联性[5]。

1.1 形态变异

甘蔗赤腐病存在形态变异，早期研究工作者根据培养菌落颜色、菌丝形态和孢子形成将赤腐病菌分为了浅色小种和深色小种（light type和dark type）[5-7]，而浅色小种产生丰富的分生孢子，毒性也比深色小种要强[6]。Malathi 等通过对亲本品种进行致病性差异研究，发现虽然各菌株能够侵染所有的参试品种，但是热带致病型比亚热带致病型毒力更强，认为分生孢子盘萌生、孢子形成与致病型毒力相关[8]。

1.2 致病性变异

虽然菌株在培养性状及形态特征上表现出变异，但是仅用这些性状进行变异分类并不可靠，因此，基于不同寄主进行致病性测定被用来进行变异研究。甘蔗赤腐病菌致病力的差异主要表现在同一菌株对不同寄主的致病力差异或不同菌株对同一寄主的致病力差异。

上个世纪初美国首次报道了甘蔗赤腐病菌致病性变异[9]，随后国外许多研究者对该病害病原菌致病性变异进行了大量研究，特别在印度研究较为全面。Sangdit 等根据致病性将泰国甘蔗赤腐病菌分为两个小种（致病的和不致病的）[10]。而印度甘蔗赤腐病菌有11 种致病型（CF01～CF11），其中亚热带地区有7 种而热带地区有4 种[11-12]。早期，Beniwal 等鉴定了亚热带地区品种Co 1148、Co 7717 和CoJ 64 上的3 种致病型，分别为CF 01、CF 02、CF 03[13]。随后Padmanaban 等从品种Co 419、Co 997 和CoC 671 分离到3 种致病型，分别为Cf 419、Cf 997 和Cf 671，后被命名为CF04、CF05、CF06[14]。20 世纪80 年代，从热带地区品种Co 419、Co 658、Co 997、Co 6304 上分离的致病菌株被用于甘蔗抗赤腐病品种筛选[15]。然而，Viswanathan 等研究表明，与之前所用的致病型相比，分离自品种CoC 671、CoC 85061、CoC 86062 和CoC 92061 的菌株表现出更强的致病力[16]，致病型Cf 671和Cf 92061具有很强的侵染力并给泰米尔纳德邦、安得拉邦的许多地区及古吉拉特邦、卡纳塔克邦的部分地区甘蔗造成巨大损失[17]，虽然新致病型如Cf 92061、Cf 90063 和Cf 767 毒性比Cf 671 强[18]，但是它们不能长期维持其毒性，并在几年后毒性减弱[12]，而新致病型Cf 671 能维持其毒性多年，因此20 多年来印度用Cf 671进行抗赤腐病筛选[15]。然而，2004年，Viswanathan从品种Co 94012分离到新致病型Cf 94012，并用32个甘蔗品种对致病型Cf 671和新致病型Cf 94012进行了连续7年的致病力试验观测，结果显示新致病型Cf 94012 比致病型Cf 671 毒性更强[15]。同样，Prittesh 等分离的cf CHA 菌株毒性较强，可侵染7个甘蔗品种，并筛选到高抗甘蔗品种Co 94004。国外一系列的致病性研究结果表明，甘蔗赤腐病菌致病性变异频繁，常造成许多抗病品种丧失抗性而成为感病品种[19]。病原菌致病性研究是抗病资源挖掘和筛选的基础与关键，而我国甘蔗赤腐病致病型及其变异情况目前尚未明确，急需开展相关研究工作。

1.3 分子变异

随着分子技术的快速发展，PCR分子标记技术被广泛应用于分子变异研究，为植物病原菌的遗传差异鉴定提供了新的方法和手段，如RAPD、ISSR 等技术。Madan 等用RAPD 分子标记技术，用6 对引物对分离自哈里亚纳邦的5 个菌株进行了多样性研究，多态性只有23%，UPGMA 聚类分析将所有菌株分为了2 个类群[20]。Mohan 等用61 对RAPD 引物对赤腐病菌进行扩增，多态性为76%[21]。Suman 等用40 对RAPD 标记对6个标准菌株进行扩增，多态性为78.6%，遗传差异超过50%，UPGMA 聚类分析将所有菌株分为两个类群[22]。Malathi 等用ITS 将印度热带和亚热带的9 个致病型分为两个类群[8]。Kumar 等对分离自印度亚热带地区的甘蔗赤腐病菌进行了种群遗传结构研究，用RAPD、URP和ISSR分子标记将25个菌株划分为6 个类群，遗传相似性为34%，表明这些菌株遗传多样性丰富[23]。

2 甘蔗赤腐病快速分子检测技术

目前已开发出甘蔗赤腐病快速分子检测技术，Nithya等用RAPD 引物OPE-01 从赤腐病菌基因组扩增出560 bp 片段，并基于此序列设计了一对SCAR标记引物，通过特异性验证，SCAR-F/R引物只对甘蔗赤腐病菌有很高的特异性，而对其他炭疽菌没有特异性，引物为SCAR-F 5′-CCTACCCAACCGAGTATCG-3′和SCAR-R 5′-GCGCAGCTTGCTCTCAAGAGC-3′，扩增产物为442 bp[24]。吴伟怀等建立了甘蔗黑穗病和赤腐病双重PCR 检测体系，甘蔗黑穗病引物为CLS 320F/R，甘蔗赤腐病菌的引物为SCAR-F/R[24-26]。Chandra等通过设计两对外引物及两对内引物，筛选出3组LAMP特异性引物（RRSC1、RRSC4、RRSC5），建立了一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）检测甘蔗赤腐病菌的方法，并对LAMP 反应体系进行了特异性和灵敏性检测，其灵敏度比普通PCR（SCAR-F/R引物）检测技术要高5～10倍，实现了该菌检测的可视化[27]。

3 甘蔗抗赤腐病研究

目前，甘蔗抗赤腐病研究主要集中在甘蔗品种抗病性研究、抗病分子标记及诱导抗病性几个方面。

3.1 甘蔗品种抗病性研究

甘蔗品种寄主抗性、蔗糖含量与病原菌毒力具有相关性。Malathi等用6 个甘蔗品种的12 个基因型研究了赤腐病菌变异与寄主抗性的关系，培养研究表明赤腐病菌毒力相关因素（生长、孢子形成和分生孢子萌发）与寄主抗性呈负相关，与不同甘蔗品种蔗汁蔗糖含量呈正相关；致病性研究表明，通过赤腐病菌致病型鉴别不同品种寄主抗性要有选择性，尤其是毒力较弱的菌株对蔗糖含量低的甘蔗品种侵染效果好，因此为了有效筛选，不同品种基因型的选择取决于致病型毒力，必需选择侵染好的优势菌株[28]。

作物受到病原体侵染、紫外辐射、低温等不良刺激后会合成各种次生代谢产物、病程相关蛋白等进行防御。早期Viswanathan 等报道了抗赤腐病甘蔗品种中植保素合成比感病品种多[29]。Malathi 等进行了更进一步的研究，利用高效液相色谱仪分析了抗病甘蔗品种（Co 93009）和感病甘蔗品种（COC 671）接种赤腐病菌后植保素的合成情况，结果显示抗病品种在接种赤腐病菌后合成了两种植保素木樨黄定（Luteolinidin）和芹菜定（Apigeninidin），接种24 h 后在感抗品种中都检测到木樨黄定（Luteolinidin），但是48～72 h 后在抗病品种中增加而在感病品种中不变，在接种赤腐病菌48～72 h 后只在抗病品种中检测到芹菜定（Apigeninidin），并非常明确地证明了抗病品种在较高水平上特异性诱导了3-脱氧花色素（3-deoxyanthocyanidins），此外还发现在抗病品种中这种诱导当时是快速的[30]。Viswanathan等研究表明，在接种赤腐病菌后抗病品种Co 93009较早地积累了几丁质酶（Chitinase）和类甜蛋白（Thaumatin-like protein）等病程相关（PR）蛋白，而感病品种（CoC 671）此类诱导显著延迟[31]。

3.2 抗病分子标记

开发抗病分子标记技术，可加快抗病育种进程。Alvi 等利用RAPD 分子技术研究了12 个抗赤腐病甘蔗品种和5个感病品种基因型的遗传差异，感病和抗病甘蔗基因型间的平均遗传相似性为74.37%，这表明大部分基因组是相似的，甘蔗基因型多态性程度与抗或感赤腐病无关联[32]。Virupakshi 等用ISSR 标记分析了7个抗/中抗赤腐病和5 个感赤腐病甘蔗叶绿体和线粒体基因组，UPGMA 聚类分析将甘蔗品种分为抗/中抗和感病两个聚类，该结果表明该标记是抗病品种鉴定、遗传关系分析和多样性评价的一个新的有力工具[33]。Jayashree等用抗病基因同源序列（RGA）策略，从抗性蛋白的保守结构域设计了29个RGA引物，对赤腐病抗性不同的40 个甘蔗品种进行遗传多样性分析，结果显示品种间遗传相似性范围为58.4%～90%，平均遗传相似性为74.2%，聚类分析将感病和抗病品种明显地区分开，共鉴定出14 对引物扩增出的25 个特异片段与抗性相关，8对引物扩增出的8 个特异片段与感病性相关，这些被发现与品种抗/感赤腐病相关联的抗病基因同源序列是一种有价值的标记来源，可在育种中用于筛选抗赤腐病材料[34]。同样，Sharma 等用抗病基因同源序列策略鉴定了18 个片段与抗赤腐病关联，可作为抗病特异性标记，7 个片段与感赤腐病关联，可作为感病特异性标记[35]。Singh 等利用SSR 标记对赤腐病抗性不同的30 个甘蔗基因型进行了遗传多样性研究，聚类分析清楚地区分了所有的基因型，抗病基因型（ISH150和SES594）明显地处于一个聚类，而其余的基因型分成两个明显的聚类，将中抗和易感甘蔗基因型分开[36]。Singh 等发现SSR 标记中UGSM316850和UGSM31660与中抗品种紧密关联，而UGSM316400与高感品种密切关联[37]。

3.3 诱导抗病性研究

诱导抗病性主要是通过外来因子对植物的刺激来激活和调控植物自身免疫反应以抵御外来病原菌侵染。目前研究较为深入的有系统获得抗性(system acquired resistance,SAR)和诱导系统抗性(Induced system resistance,ISR)。

植物诱导抗病剂苯并噻二唑[Acibenzolar-S-methyl，benzo（1，2，3-thiadiazole-7-carbothioic acid-S-methyl，BTH）]是一种人工合成的SA 类似物，BTH 本身不具有直接的抑菌作用，但能诱导植物产生抗性从而有效抵御病原菌的侵染。Sundar等分别用100µg/mL的苯并噻二唑（Acibenzolar-S-methyl）、水杨酸（Salicylic acid）、异烟酸（Isonicotinic acid）和丁二酸（Succinic acid）对高感赤腐病品种CoC 671 和CoC 92061系统获得抗性诱导（SAR）进行对比研究，结果显示所有诱导抗病剂处理后的甘蔗由高感变为中抗，其中苯并噻二唑诱导了较高水平组织抗性，有效限制了病原菌的定植，并伴随着过氧化物酶（POX）和多酚氧化酶（PPO）的显著提高，证明了氧化酶的诱导是系统获得抗性的机制之一[38]。同样Ashwin 等试验结果也证明了诱导系统获得抗性抵御甘蔗赤腐病的几个诱导抗病剂中苯并噻二唑是最有效的[39]。

Viswanathan 等早期研究表明，荧光假单胞菌可诱导系统抗性（ISR），从而显著减少赤腐病菌定植，减少糖分损失；随后对不同抗性甘蔗品种进行了荧光假单胞菌诱导系统抗性研究，结果显示高感品种诱导抗病性比中抗和中感品种更显著，该结果表明对于抵御赤腐病，与甘蔗固有的寄主防御机制相比，诱导系统抗性不显著；此外，荧光假单胞菌的使用还减少了转化酶，提高了蔗汁质量[40-42]。

4 展望

4.1 甘蔗赤腐病防控

甘蔗赤腐病可对甘蔗造成巨大经济损失，初侵染源为带病蔗种和田间的病株残叶，可随风雨、露水传播进行再侵染，有效防治难度较大。而长期以来甘蔗赤腐病是我国蔗区一种次要病害，对其研究较少，但近年蔗茎赤腐病局部发生严重，缺少准确的诊断与有效的防治技术，经济损失较重[43]，现已上升为甘蔗主要病害。甘蔗赤腐病菌容易发生变异，新致病性小种的产生导致甘蔗品种抗病性“丧失”，即使种植抗病品种，在8～10年内该品种也会因新的更具致病性小种的出现而感病[44]，单一的防治方法并不能有效减轻甘蔗赤腐病造成的损失。应避免长期种植单一高感品种ROC 1、ROC 22、ROC 16、台糖89-1626、粤糖93-159、粤糖00-236[2,45]；蔗种可用木霉菌（Tichodermaspp.）、假单胞菌（Pseudomonasspp.）、芽孢杆菌（Bacillusspp.）等生物防治剂进行蔗种及土壤处理进行防控[45]；蔗茎上的螟虫蛀孔是赤腐病菌孢子主要的侵入通道[2]，应加强对螟虫的监控，采用频振式杀虫灯或性诱剂诱杀成虫，或释放赤眼蜂等进行螟虫防控[46]；同时应加强田间管理，减少杀菌剂的使用，结合多种绿色防治手段进行综合绿色防控，有效控制病害大面积发生流行，减轻危害损失，实现甘蔗赤腐病的可持续控制[45]。

4.2 甘蔗赤腐病菌群体遗传结构研究

与国外相比我国对该病害研究相对薄弱，目前主要集中在杀菌剂和生防菌室内筛选阶段，缺乏深入系统的研究，甘蔗赤腐病病原菌群体遗传结构及甘蔗品种抗性情况尚未明确，阻碍了抗病品种的利用及精准防控的实施。今后，科研工作者应积极开展甘蔗赤腐病不同地理环境病原菌群体的鉴定、系统进化及多样性研究，掌握不同生态区甘蔗赤腐病主要致病菌类群，深入研究赤腐病菌致病机理、成灾规律，这对开展相应的抗性研究及利用具有重要意义；并对赤腐病菌抗药性进行实时监测，利用已开发的简便、快速、高效且不需昂贵仪器及实验条件的环介导等温扩增技术（LAMP）进行检测[47]，该方法有利于在基层推广使用。

4.3 甘蔗赤腐病抗病基因挖掘

中国国家甘蔗种质资源圃保存有6 个属16个种的2 800余份各类甘蔗种质资源材料，是中国乃至世界甘蔗遗传改良的巨大珍贵基因库，是抗病基因的重要来源，稳定多抗的甘蔗品种种质资源是进行赤腐病抗性育种的基础和关键，在未来的研究工作中，利用分子标记育种技术提高育种效率，从巨大种植资源库充分挖掘甘蔗品种抗病基因，筛选优良种质资源，全面解析甘蔗赤腐病的抗病遗传规律和抗性机制，发掘和定位在不同环境中能稳定表达的主效QTL。