新月菱形藻(Nitzschia closterium)制备参数对藻球性质及去氮磷效果的影响

黄 晨, 蒋霞敏, 韩庆喜, 彭瑞冰, 周爽男

新月菱形藻()制备参数对藻球性质及去氮磷效果的影响

黄 晨, 蒋霞敏*, 韩庆喜, 彭瑞冰, 周爽男

（宁波大学 海洋学院, 浙江 宁波 315832）

为了制备出高效的固定化藻球, 完善固定化藻球的制备工艺, 以新月菱形藻为藻种, 采用褐藻胶包埋技术和单因子试验, 研究了不同褐藻酸钠质量分数(2.0％、2.5％、3.0％)和不同溶剂(海水、蒸馏水、NaCl溶液)对藻球形状、强度、传质性、去除氮磷效果及藻细胞生长的影响. 结果表明: 不同褐藻酸钠质量分数对藻球形状影响显著(<0.05), 褐藻酸钠质量分数为2.0％和2.5％时藻球呈球形, 为3.0％时藻球呈不规则的水滴形; 不同溶剂种类对藻球形状则无影响. 不同褐藻酸钠质量分数对藻球强度影响显著(<0.05), 随着褐藻酸钠浓度的增加, 藻球强度逐渐增强; 不同溶剂对藻球强度的影响显著(<0.05), 影响大小的排序为海水>NaCl>蒸馏水. 不同褐藻酸钠质量分数和不同溶剂对藻球传质性影响显著(<0.05), 随着褐藻酸钠浓度的增加, 藻球传质性也逐渐增强; 溶剂对传质性影响的强弱排序为海水>NaCl>蒸馏水; 不同褐藻酸钠质量分数和不同溶剂对固定化藻球藻细胞生长及去氮磷效率影响显著(<0.05), 其中以3.0％褐藻酸钠+海水的藻细胞生长最快, 去除氮磷效率最佳.

褐藻酸钠浓度; 溶剂种类; 固定化新月菱形藻; 藻球性状; 生长速率; 氮磷去除效率

固定微藻的方法主要有3种: 包埋法、交联法和载体结合法[1], 目前研究最多的是包埋法. 微藻固定化包埋技术是指将游离的微藻细胞通过固定和包埋等方法将游离的微藻细胞固定在载体上的方法[2], 其原理是让藻细胞扩散, 进入到多孔性载体的内部, 或利用高聚物等在形成凝胶时将藻细胞包埋在内部[3]. 包埋法的优点是在固定化过程中藻细胞活性丧失少, 固定化藻球的强度高、传质性能较好、性质较稳定等[4-6]. 固定化技术使藻细胞不仅有温和的环境, 且不易受外界的影响, 藻群较易控制, 能反复的使用, 在一定程度上可提高利用率; 同时具有较高的藻细胞浓度, 反应速度快. 另外, 藻类的固定化有利于固液分离, 便于藻的收获和综合利用[7-8]. 目前国内外研究较多的是淡水固定化微藻, 有关海水固定化微藻鲜有报道[9-10].

新月菱形藻()隶属硅藻门、羽纹硅藻纲、管壳缝目、菱形藻科、菱形藻属, 是常用的单细胞饵料种, 具有生长繁殖快、易培养等优点. 本文以新月菱形藻为藻种, 褐藻酸钠为固定化载体, 分别以蒸馏水、海水和NaCl溶液为溶剂, 探究不同浓度褐藻酸钠和不同溶剂对藻球形状、藻球强度、藻球传质性、藻细胞生长及其去除氮磷的影响, 旨在为微藻固定化培养与养殖污水的治理提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用的新月菱形藻来自宁波大学海洋学院藻种室. 培养液配方采用宁波大学3#培养液(表1). 培养用水采用象山港天然海水, 经沙滤、暗沉淀、脱脂棉过滤和烧开冷却. 将藻种置于GXZ智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂)培养, 培养条件: 温度(25±1)℃, 盐度25, 光照强度4500lx, pH 7.86, 光暗周期L:D(12h:12h), 不充气. 实验采用人工模拟污水, 即在缺氮的3#母液中加入一定量的NH4Cl (NH4+-N质量浓度为17mg·L-1).

表1 宁波大学3#培养液配方

脱固定化方法: 在测定固定化藻细胞密度时先脱固定化, 即将固定化藻球放入盛有一定量3.0％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)化解液中, 摇动, 直至固定化藻球完全溶解成悬浮状, 再测定藻细胞密度.

1.2 实验设计

1.2.1 固定化藻球制作方法

藻的固定化采用褐藻酸钠包埋, 即将处于对数生长期的蛋白核新月菱形藻液置于立式高速离心机(ELITIST 15K), 以3000r·min-1离心10min, 弃上清液, 用少许消毒海水溶解备用. 采用不同溶剂(海水、蒸馏水、NaCl溶液)和不同质量分数(4.0％、5.0％和6.0％)的褐藻酸钠, 搅拌制成均一的凝胶, 在干热灭菌锅(YX-280B)中120℃高压灭菌1h, 冷却至室温((25±3)℃). 将褐藻酸钠与浓缩藻液按体积(1:1)混合, 搅拌制成均一的褐藻酸钠藻胶. 用制粒机在距离3.0％CaCl2溶液液面5cm处, 制成直径约3mm的藻球, 固定2h, 用不同褐藻酸钠质量分数(2.0％、2.5％、3.0％)和不同溶剂(海水、蒸馏水、NaCl溶液)制备藻球.

1.2.2 不同藻球的形状、强度及传质性试验

将制成的9种不同的固定化藻球, 分别用显微镜、质构仪(TMS-PRO)和分光光度计(UV2800AH)进行分析.

1.2.3 不同藻球对藻生长及去氮磷效果试验

将制成的9种固定化藻球用250mL三角烧瓶培养, 加入人工模拟废水200mL, 加藻球5g, 每组设3个平行, 并设不加藻球的空白组. 培养条件同1.1节, 培养时间9d, 隔天测定水体中NH4+-N和PO43--P浓度. 始末用血球计数板法对藻细胞计数.

1.3 测定指标

藻球形状测定: 采用显微镜法, 用镊子取出制备的试验藻球, 置于吸水纸上, 除去多余的水分, 用美工刀将藻球对切成两半, 横切面向上置于载玻片上, 盖上盖玻片, 在40倍显微镜下观察, 并拍照记录.

藻球强度测定: 采用质构仪的测试方法, 每组样品用镊子取出5~10颗藻球, 置于吸水纸上, 除去水分; 再夹取1颗藻球置于测试台面中心, 启动测定按钮, 读取数据. 每个样品测试3次.

藻球传质性测定: 将分光光度计的波长调至600nm, 取0.2mL的蓝墨水加入比色皿中, 再加入50mL纯水进行稀释并摇匀. 分别取不同藻球(9 种)各4g, 浸泡时间3 min, 从各比色皿中依次吸取5mL墨水, 加入20mL纯水稀释, 用未放胶球的对照组依次润洗比色皿2次, 测量并记录数据.

生长速率测定: 始末取20mL3.0％的Na3C6H5O7溶液加入离心管中, 再在各试验组中取1g藻球加入离心管, 溶解2~3h, 搅拌, 用血球计数板法计数, 藻细胞生长速率的计算公式为:

=(ln1-ln0)/(1-0),

式中:0为培养开始时间;1为培养结束时间;0、1分别为0、1时期的藻细胞密度.

NH4+-N和PO43--P测定: 用纳氏试剂分光光度法测NH4+-N, 用磷钼蓝分光光度法测PO43--P[7]. 氮磷去除率的计算公式为:

=(0–1)/0,

式中:0为初始氮磷浓度;1为第天的氮磷浓度.

1.4 数据处理

采用Excel 2016进行处理数据, 并用SPSS 23.0软件对试验数据进行Duncan和单因素的方差分析, 以及多重比较分析, 以<0.05作为差异显著性判断标准.

2 结果与分析

2.1 不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球形状的影响

不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球形状的影响显著. 当褐藻酸钠质量分数为2.0％时, 3种溶剂制成的藻球均呈球形; 当褐藻酸钠质量分数为2.5％时, 海水和2.0％NaCl制成的藻球呈球形, 蒸馏水制成的藻球呈亚梨形; 而当褐藻酸钠质量分数为3.0％时, 3种溶剂制成的藻球均呈不规则的水滴形(图1).

1为2.0％褐藻酸钠+蒸馏水; 2为2.0％褐藻酸钠+海水; 3为2.0％褐藻酸钠+NaCl; 4为2.5％褐藻酸钠+蒸馏水; 5为2.5％褐藻酸钠+海水; 6为2.5％褐藻酸钠+NaCl; 7为3.0％褐藻酸钠+蒸馏水; 8为3.0％褐藻酸钠+海水; 9为3.0％褐藻酸钠+NaCl. 下图同.

2.2 不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球强度的影响

不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球强度的影响如图2所示.

从图2可知, 实验末期的藻球强度均小于实验初期的强度(<0.05); 实验证明不同褐藻酸钠浓度对藻球强度的影响显著(<0.05), 固定化强度随着褐藻酸钠浓度的增大而增强, 藻球强度大小排序为3.0％褐藻酸钠>2.5％褐藻酸钠>2.0％褐藻酸钠; 不同溶剂对藻球强度的影响显著(<0.05), 藻球强度按大小排序为海水>NaCl>蒸馏水. 在实验组中强度最大的是3.0％褐藻酸钠+海水组, 在实验初期和末期强度分别为185g和151g.

2.3 不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球传质性的影响

不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球传质性影响显著(图3). 在前3min, 吸光度的降速远大于后6min; 不同褐藻酸钠浓度对藻球传质性也有显著影响(0.05), 其中传质性最好的是3.0％褐藻酸钠浓度组, 平均为31.33％; 2.0％和2.5％褐藻酸钠组传质性较差, 两者不存在显著性差异(0.05). 不同的溶剂对藻球传质性影响显著(0.05), 其中传质性最好的是海水组, 平均为35.33％; 传质性较差的为蒸馏水和NaCl组, 两者不存在显著性差异(0.05); 实验中传质性较好的是3.0％褐藻酸钠+海水组和3.0％褐藻酸钠+蒸馏水组, 吸光度分别为30％和31％, 与其他组存在显著性差异(0.05); 传质性最差的是2.5％海藻酸钠+NaCl组, 吸光度为44％, 与其他组存在显著性差异(0.05). 从传质性角度分析, 效果好的组可在单位时间内吸收更多的营养素和较少的水分.

2.4 不同浓度的褐藻酸钠与不同溶剂对藻球生长的影响

不同褐藻酸钠浓度和不同溶剂对藻球生长的影响如图4所示. 实验组值在0.2635~0.4457之间; 不同的褐藻酸钠浓度对藻球生长影响显著(0.05), 2.0％、2.5％和3.0％褐藻酸钠组的值分别为0.3066、0.3333和0.3645. 不同溶剂对藻球生长影响显著(0.05), 其中生长最好的是海水组,值为0.3467; 蒸馏水和NaCl组,值分别为0.3254和0.3216, 两者不存在显著性差异(0.05). 在实验组中生长最好的是3.0％褐藻酸钠+海水组,值为0.4457, 与其他组存在显著性差异(0.05); 传质性最差的是2.0％海藻酸钠+海水组,值为0.2635, 与其他组存在显著性差异(0.05). 从生长角度分析, 效果好的组可在单位时间内获得更高的生长速度.

2.5 不同的褐藻酸钠浓度和不同溶剂对藻球氮磷去除的影响

不同的褐藻酸钠浓度和不同溶剂对藻球去氮磷的影响如图5和图6所示. 实验组9d中NH4+-N去除率为67.82％~90.61％, PO43--P的去除率为49.02％~96.68％. 不同褐藻酸钠浓度对藻球NH4+-N去除影响显著(0.05), 2.0％、2.5％和3.0％褐藻酸钠组对NH4+-N去除率分别为78.42％、81.71％和88.76％. 不同溶剂对藻球NH4+-N去除率影响显著(0.05), 其中NH4+-N去除率最好的是海水组, 去除率为89.82％; 蒸馏水和NaCl组较差, NH4+-N去除率分别为80.92％和78.16％, 且两者不存在显著性差异(0.05); 实验组中NH4+-N去除率最好的是3.0％褐藻酸钠+海水组, 去除率为90.61％, 与其他组存在显著性差异(0.05); 最差的是2.0％褐藻酸钠+NaCl组, 去除率为67.82％, 与其他组存在显著性差异(0.05). 不同溶剂对藻球PO43--P去除影响显著(0.05), 其中蒸馏水组、海水组和NaCl组PO43--P去除率分别为77.59％、88.57％和69.23％, 最佳的溶剂为海水; 不同褐藻酸钠浓度对藻球PO43--P去除率影响显著(0.05), 其中去除效果最好的是3.0％褐藻酸钠组, 去除率为84.85％; 最差的为2.0％褐藻酸钠组, 去除率为68.83％. 在实验组中PO43--P去除率最好的是3.0％褐藻酸钠+海水组, 去除率为96.68％, 与其他组存在显著性差异(0.05); PO43--P去除率最差的是2.0％褐藻酸钠+NaCl组, 去除率为49.02％, 与其他组存在显著性差异(0.05).

3 讨论

3.1 不同的固定化藻球制作方法对藻球外部的影响

固定化藻球需具有较高的粒度、强度和孔隙度等, 否则藻细胞容易脱落, 同时载体必须利于物质交换, 便于藻对营养盐和CO2的吸收[11-12]. Eroglu等[13]研究了不同来源的褐藻酸钠盐作为细胞固定化基质的性质, 发现褐藻酸盐的黏度与其分子量成正比, 褐藻酸钠浓度影响胶球的机械强度, 当浓度大于一定值时, 主要受浓度影响. 在本研究所制成的不同浓度褐藻酸钠藻球, 不仅导致制成的藻球的黏度有差别, 而且导致藻球形状差别很大, 2.0％褐藻酸钠都为规则的球形, 而3.0％褐藻酸钠则为水滴形. 这是由于在成球过程中, 褐藻酸钠中Na+与固定液Ca2+置换造成. 海水和2.0％NaCl中含有游离Na+离子, 会增大成球的黏性.

3.2 不同固定化藻球制作方法对藻球内部的影响

随着褐藻酸钠浓度的增加, 其与CaCl2溶液所形成的凝胶网络逐渐致密, 凝胶珠的机械强度增高, 藻细胞能够很好地包埋于其中, 并通过凝胶网格的孔隙获得培养液中的营养, 排除代谢物[14-15]. 这与本实验结果(最高的褐藻酸钠组(浓度为3.0％)具有最高的强度、最好的传质性、最大的生长速率和最高的氮磷去除率)相符. 在实验进行到第9天时2.0％褐藻酸钠组有部分藻球出现水解破碎, 这是由于形成的凝胶网络不够坚固, 在交换营养物质和代谢物时易被水流冲碎, 而2.5％和3.0％的褐藻酸钠组均未出现上述情况, 这与杨海波等[16]选用2.0％褐藻酸钠研究结果不一致, 其原因有待进一步研究. 在3种溶剂的比较中, 海水的效果最好, 因为相较于蒸馏水, 海水中含有大量的Na+离子, 在与CaCl2溶液交联过程中提高了凝胶中Na+离子的浓度, 从而提高了交联效果[17]; 同时, 相较于NaCl溶液, 海水中含有少量的Mg2+、K+、Sr2+等离子, 可能会对凝胶网络有加固作用, 这与Wahid 等[18]在用多层石墨烯和氧化石墨烯板片固定化新月菱形藻的研究结果相一致.

3.3 不同固定化藻球制作方法对藻球生长的影响

本实验采用包埋法对新月菱形藻进行固定化处理, 各组都有很高的生长率, 与邢丽珍等[11-12]研究结果相一致. 3.0％褐藻酸钠组虽具有较高的生长率, 但在实验结束1个月后发现其最先发黄衰败, 这和杨海波等[16]的研究结果相一致. 因此, 固定化藻球的长时间使用有待进一步研究.

3.4 不同固定化藻球制作方法对藻球氮磷去除的影响

微藻对水体氮的去除, 主要是通过吸收无机和有机氮化合物作为氮源来合成氨基酸, 其中对无机氮的利用以NH4+-N为主, 这是由于藻类缺乏活性硝酸还原酶, 因此微藻对硝氮NO3--N的吸收利用. 仅发生于NH4+-N浓度很低或耗尽时[19]. 藻类对污染水体中磷的去除, 包括藻类对磷的吸收以及对含磷化合物的表面吸附沉积, 其中主要是利用活性磷酸盐来维持藻类的生长[20-21]. 此外, 藻类生长繁殖会导致水体pH值的增加, 会将氨氮转变为氨气释放, 也会使溶解性磷酸盐与水中的钙离子形成羟基化磷酸钙物质沉淀, 最后被藻类所吸附[22]. 在本实验中, 由于3.0％褐藻酸钠组具有更高的生长率, 因此具有最高的氮磷去除率, 这与文献[23-25]的研究结果相一致, 但与文献[26]的研究结果相悖, 其原因可能与不同微藻种类以及不同藻球的制备环境有关.

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Effects of preparation parameters ofon algae ball properties and removal efficiency of NH4+-N/PO43--P

HUANG Chen, JIANG Xiamin*, HAN Qingxi, PENG Ruibing, ZHOU Shuangnan

( School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China )

The current study is aimed to prepare a highly efficient immobilized algae ball and improve its preparation process.is an algae species. Alginate embedding technique was used in the experiments. The effects of different sodium alginate concentrations (2.0％, 2.5％, 3.0％) and different solvents (seawater, distilled water, NaCl solution) on the shape, strength, mass transfer, as well as nitrogen and phosphorus removal of algae were examined, with the effects of algal cell growth also studied. The results showed that different sodium alginate concentrations produced significant effects on the shape of algae spheres (0.05). When the concentration of sodium alginate was either 2.0％or 2.5％, the algae spheres were spherical. In contrast, the algae spheres were irregular at a sodium alginate concentration of 3.0％. Solvent types failed to significantly alter the shape of the algae sphere. The concentration of sodium alginate produced a significant effect on the strength of the algae sphere (<0.05). With the increased concentration of sodium alginate, the strength of the algae sphere also increased. The effect of solvent on the strength of algae was significant (0.05). The strength of algae was sorted by size: seawater>NaCl>distilled water. There was a significant effect of the mass transfer of algae, the concentrations of sodium alginate and solvents (<0.05). As the concentration of sodium alginate increased, the mass transfer of algae gradually increased. In the presence of solvent, mass transfer was evident. The performance was seawater>NaCl>distilled water. The growth of immobilized algae cells was significantly affected by concentrations of sodium alginate and solvents (0.05). Algae cells with 3.0％ sodium alginate+seawater showed the fastest growth speed and the denitrifying phosphorus with 3.0％ sodium alginate+seawater showed the greatest efficiency.

concentration of sodium alginate; solvent species; immobilized; algal globular traits; growth rate; ammonia nitrogen and orthophosphate removal efficiency

S917.1

A

1001-5132（2020）01-0032-06

2019−08−11.

宁波大学学报（理工版）网址: http://journallg.nbu.edu.cn/

浙江省公益项目（2015C3204）; 宁波市科技项目（2015C10062）; 温州市科技计划项目（2018ZS002）.

黄晨（1996－）, 男, 浙江宁波人, 在读硕士研究生, 主要研究方向: 微藻定向培养. E-mail: 2074207292@qq.com

蒋霞敏（1957－）, 女, 浙江舟山人, 博导/教授, 主要研究方向: 水产养殖与饵料生物培养. E-mail: jiangxiamin@nbu.edu.cn

（责任编辑 史小丽）