FTIR方法和HPLC指纹图谱鉴别不同产地荜茇

张慧文，宋晓玲，石松利，张莎莎，梁 越，王焕芸*

1. 内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110 2. 包头医学院药学院，内蒙古 包头 014040 3. 内蒙古自治区人民医院，内蒙古 呼和浩特 010017

引 言

荜茇(PiperlongumL.)是药食同源性中药，也是蒙、藏、维医的习用药材[1]。其辛，热，归胃、大肠经。现代药理研究表明荜茇具有抗氧化、降血脂等药理活性，临床常用于治疗胃痛、腹泻等消化系统疾病[2]，日常被用作香料或调味剂。荜茇富含多种酰胺类生物碱，《中国药典》采用高效液相色谱法检测胡椒碱[3]，已有文献报道了其中荜茇宁的含量检测，这些质量控制方法缺乏整体性和创新性[4]。

中药材以多组分整体入药，其中单个或几个目标成分的检测和控制难以反映药材质量，因此人们采用红外或HPLC指纹图谱等方法进行药材的整体性分析。荜茇的HPLC指纹图谱具有整体性，可全面反映药材质量，但是需要大量的标准品才能确定其成分含量，荜茇的化学成分中仅胡椒碱有市售标准品，其余成分均需自行制备。标准品的缺乏制约了荜茇的含量测定和深入研究。而红外光谱具有快速、高效、用量少，操作简便的特点，宏观整体特征性强，可以补充HPLC指纹图谱的不足。联合应用傅里叶红外光谱法和HPLC指纹图谱对4个产地6批次的荜茇进行分析，为荜茇的综合质量评价提供一种有效的方法，用以控制中医临床用药质量，并为荜茇的食品安全提供保障。

1 实验部分

1.1 仪器与参数

Thermo Ultimate3000 DGLC双三元梯度高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher)； NICOLET-6700傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher)； JP-031S型超声波清洗仪(中国深圳市洁盟清洗设备有限公司)； 多功能粉碎机(中国浙江高鑫工贸有限公司)； BT25S型微量电子分析天平(十万分之一，美国Sartorius)； GenePureUV/UF-TOC超纯水仪(美国Thermo Fisher)。

1.2 试剂

胡椒碱购自成都曼斯特生物科技有限公司(批号： MUST-17041301，质量分数≥98%)，荜茇宁为实验室自制。溴化钾为光谱纯，甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水，其他试剂为分析纯。

1.3 样品制备

荜茇分别购自于云南、亳州、广西和海南，经内蒙古医科大学生药教研室张慧文博士鉴定为胡椒属植物荜茇。生产批号见表1。

表1 不同产地荜茇的主要信息

2.4 HPLC指纹图谱的测定

精密称取1.0 g荜茇，25 mL 70%甲醇超声提取30 min，过滤，得供试品溶液。色谱条件如下： 色谱柱： Welch Ultimate LP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司)； 流速： 1 mL·min-1； 进样量： 10 μL； 柱温： 30 ℃； 检测波长： 254 nm； 流动相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～8 min，80%～83%A； 8～11 min，83%～85%A； 11～15 min，85%～95%A； 15～30 min，95%A)。

2 结果与讨论

2.1 荜茇的红外光谱研究

2.1.1 荜茇红外指纹图谱和数据

荜茇药材分别经干燥、粉碎后，过60目筛，与KBr粉末混合研磨，压片，放入FTIR仪中测定。荜茇药材的红外光谱较为复杂，是由多种化学成分的吸收光谱重叠形成。3 000～3 500 cm-1是由于苯环上C—H的伸缩振动产生的； 2 926 cm-1附近为不饱和碳上C—H的伸缩振动； 2 855 cm-1为—CH2基的对称伸缩振动； 1 637 cm-1是烯烃的C—C伸缩振动； 1 558，1 490和1 445 cm-1为苯环的特征谱带； 1 253 cm-1是六氢吡啶环上C—H弯曲振动。

胡椒碱的红外光谱中，3 009.34 cm-1是苯环上C—H的伸缩振动； 2 940.40 cm-1是不饱和碳上C—H的伸缩振动； 1 634.40 cm-1为较宽的中强吸收峰，是酰胺基特征吸收峰，由于共轭造成红移，强度增加； 1 583.99，1 491.73和1 448.77 cm-1为苯环的特征谱带，由于共轭，波数降低，而强度增强； 1 252.93 cm-1为六氢吡啶环上C—H弯曲振动； 1 611.98 cm-1是羰基特征吸收峰。荜茇宁的红外光谱中，3 290.24 cm-1是N—H伸缩振动吸收峰； 1 645.02 cm-1为羰基伸缩振动吸收峰； 1 549.92，1 503.92，1 489.09 cm-1为苯环上的骨架C伸缩振动； 2 985.98和2 871.02 cm-1为烷基上C—H的对称、不对称伸缩振动吸收峰。

图1 荜茇、胡椒碱和荜茇宁的红外光谱图

表2 不同产地荜茇红外指纹图谱吸收峰

续表2

S42 931.332 855.852 066.451 772.791 751.75S52 925.772 855.572 093.692 064.83S62 926.812 854.442 067.071 871.291 773.371 751.85S11 655.421 637.491 614.351 592.231 545.161 503.071 490.58S21 734.671 654.131 632.771 617.51 546.61 503.971 491.53S31 737.721 658.281 622.111 613.51 558.361 516.021 490.09S41 733.161 651.491 632.51 624.941 560.891 512.561 491.37S51 734.711 654.291 630.211 560.711 504.071 491.18S61 734.731 654.031 632.631 560.661 511.991 491.79S11 445.781 387.921 367.71 319.931 253.021 194.5S21 448.471 401.211 386.341 316.681 276.331 252.82S31 447.321 400.941 318.071 275.861 252.58S41 448.531 401.171 386.481 317.861 278.471 252.69S51 445.391 401.241 385.331 319.111 251.61S61 448.981 401.31 277.531 252.73S11 156.581 135.221 117.491 080.571 034.861 020.82998.68S21 134.581 115.6999.32S31 134.611 114.2S41 134.651 115.28S51 134.37S61 152.761 134.921 068.43S1929.44858.16767.02703.94680.77668.18646.32S2929.97847.46831.5763.82678.97668.38634.74S3930.33847.73831.83781.33678.94668.07635.59S4930.16847.25830.83679.23668.31632.85S5929.29854.25763.81668.74638.81S6929.84847.34831.08678.7668.44624.02S1609.34573.96527.09523.82480.44436.61S2615.78534.84517.65474.1S3616.38536.29473.63422.83S4611.48531.57461.72423.66S5616.9576.91532.17428.86S6607.35531.6516.62473.38427.95

2.1.2 共有峰率和变异峰率双指标序列

依据红外光谱共有峰率和变异峰率计算公式[5]，建立荜茇的双指标分析序列(表3)。广西产荜茇(S3和S4)的共有峰率最高为82%，亳州(S2)和广西产荜茇(S3和S4)的共有峰率均较高，分别为79%和80%； 样品S6与样品S2，S3，S4共有峰率较高为73%, 74%, 76%。样品S1与其他样品的共有峰率是最低的，而变异峰率是最高的，提示S1与其他样品的差异较大。

2.2 荜茇的指纹图谱研究

使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012》分析，标定17个指纹图谱共有特征峰，相似度结果均大于0.96，相似度良好。由于2号峰(胡椒碱)的重现性和分离度都较好，峰形对称，峰面积较大，因此将胡椒碱的色谱峰定为参照峰(S峰)。HPLC指纹图谱结果表明各产地荜茇药材所含成分基本相同(在254 nm下测定)，其中胡椒碱是含量最大的生物碱，但从峰面积看，含量大小有所区别。荜茇中胡椒碱和荜茇宁的含量在4个产地中，安徽亳州和广西较高。

3 结 论

同时采用傅里叶红外光谱法和HPLC指纹图谱考察4个产地6批次荜茇，结果显示两种分析方法对药材评价结果基本一致，各批次荜茇的化学成分基本相同，质量比较稳定，其中云南产荜茇(S1)与其余5批次荜茇有一定差异。中药红外光谱中包含多种化学成分的重叠峰，需要建立共有峰率和变异峰率双指标序列，从整体上评价药材品质。结果表明红外光谱与HPLC指纹图谱均能从化学成分的角度评价药材的质量，具有整体性和综合性[6]，指纹图谱仅显示在固定波长条件下有紫外吸收的化合物，同时红外光谱具有多种优点，如操作简便、无化学污染、分析速度快等，因此红外光谱在分析复杂中药的成分体系中更具有优势。

表3 不同产地荜茇的双指标序列

图2 荜茇的HPLC指纹图谱

表4 指纹图谱相似度结果

表5 胡椒碱和荜茇宁的含量

荜茇的HPLC指纹图谱显示有17个共有峰，其中含量最大的是胡椒碱，相似度结果表明云南产荜茇(S1)与其余5批次荜茇差异略大，其结果与红外光谱结果相同。同时进行了主要成分胡椒碱和荜茇宁的含量检测，云南(S1)和海南(S5，S6)产荜茇中胡椒碱和荜茇宁含量较低，而安徽亳州(S2)和广西(S3，S4)的含量较高，与红外光谱和HPLC指纹图谱的结果有一定的差异，说明中药材的质量控制方法应考虑整体性。将红外光谱和HPLC指纹图谱联合应用于荜茇的质量控制研究，两种方法互为补充，操作简便，样品使用量少，可做为药材快速鉴别的新方法，为荜茇的化学成分、质量控制和开发应用提供研究基础和依据。