超声波辅助提取葛根总黄酮的工艺研究
2020-01-08
(昭通学院 化学化工学院，云南 昭通 657000)
葛根[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]，习称野葛，为豆科植物野葛的根茎，我国资源丰富，多产于云南、贵州、四川、河南、山西等地[1]。葛根作为药食两用植物，可以提高人体内肝细胞的生长能力，恢复人体内正常的肝脏功能。同时，它可以促进人体内胆汁的分泌，并能有效的消耗人体内积累的脂肪，从而减少脂肪肝等疾病的发生[2, 3]。现代药理研究表明，葛根中含有黄酮类、三萜类、生物碱类等多种化合物，其中黄酮类化合物是葛根中的主要有效活性成分之一。葛根总黄酮不但具有解酒、镇痛、解热等功效，还有抗肿瘤、抗氧化、降血压和治疗心血管疾病等作用[4-6]。近年来，随着生活水平的提高，人们的保健意识逐渐增加，保健品的开发日趋受到人们关注。葛根总黄酮有着丰富的生物活性，以葛根作为原材料提取黄酮类化合物用于保健品开发和利用正方兴未艾[7,8]。目前，从葛根中提取黄酮类化合物有多种方法，诸如渗漉法、浸提法、酶解法和超声波辅助提取法等[9]。超声波辅助提取法与其它方法相比，具有提取的总黄酮活性成分较高、提取率高、耗能较小、时间短、设备简易和操作简单等特点[10]。本文以乙醇浓度、超声时间和料液比3个单因素进行超声波辅助提取葛根中的总黄酮，并在在单因素试验的基础上，通过正交试验优化超声波辅助提取普洱葛根中总黄酮的提取工艺。为葛根综合开发利用提供一定的参考依据。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
葛根材料采集于2018年9月云南普洱市。
芦丁对照标准品(中国药品生物制品鉴定所，批号10081-9905)、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯(上海化学试剂厂)。
1.2 仪器
UNICO7200可见光分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；FA2004电子精密天平(上海右一仪器有限公司)；101型电热鼓风干燥烘箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SK5200LHC超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)；XFB-200家用粉碎机(湖南省吉首市中机械厂)等。
2 实验方法
2.1 原料预处理
将葛根洗净晾干，放入75 ℃的干燥箱中烘干至恒重，用粉碎机粉碎过80目筛，得到葛根粉末，装入密封袋中保存备用。
2.2 标准曲线的绘制
分别移取质量浓度0.824 8 mg/mL的芦丁标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL比色管中，各管中分别加入0.4 mL质量分数5%的亚硝酸钠溶液，震荡摇匀，室温放置5 min，加入0.4 mL质量分数10%的硝酸铝溶液，震荡摇匀，室温放置5 min，再加入4.0 mL质量分数2%的氢氧化钠溶液，用去离子水定容至10 mL刻度，充分摇匀，室温放置30 min。以第一只试管的溶液作为空白对照，于波长为510 nm处测定吸光度，平行测定三次取平均值。以芦丁质量浓度x为横坐标，吸光度y为纵坐标，绘制标准曲线。
2.3 葛根中总黄酮的测定
准确称取1 g葛根干燥粉末于具塞锥形瓶中，在不同乙醇体积分数、超声时间和料液比3个因素下超声(53 kHz, 200 w)辅助浸提，将所得提取液稀释定容至50 mL，准确移取2 mL于10 mL比色管中，按照2.2法测定吸光度，按下式计算葛根总黄酮浸出率。
c为提取液总黄酮的质量浓度(mg/mL)；v为提取液的体积(mL)；n为提取液的稀释倍数；m为葛根粉末质量(mg)。
2.4 单因素试验
以乙醇体积分数(35%、50%、65%、80%、95%)、超声时间(12、24、36、48、60 min)、料液比(1∶10、1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50 (g/mL))3个单因素进行超声(53 kHz, 200 w)辅助浸提葛根中的总黄酮，并测定出各组总黄酮的含量。
2.5 正交试验设计
在单因素试验基础上，以乙醇体积分数(A)、超声时间(B)和料液比(C)作为研究因素，每个因素下设定3个水平，进行正交试验，确定超声波辅助提取葛根中总黄酮的最佳工艺条件。正交试验设计如表1所示。
表1 正交试验因素及水平Tab. 1 Factors and levels of orthogonal test
3 结果分析
3.1 标准曲线回归方程
根据2.2项操作，得到各组芦丁质量浓度对应的吸光度，通过计算机对实验数据进行线性拟合，得到标准曲线回归方程为y=9.625x-0.003 8，线性相关系数r=0.999 8，说明芦丁质量浓度在0～0.824 8 mg/mL呈现良好的线性关系，该回归方程可以用作葛根中总黄酮的含量测定。
3.2 单因素试验
3.2.1 乙醇浓度
固定料液比为1: 30 (g/mL)，超声提取时间为24 min，分别以乙醇体积分数为35%、50%、65%、80%、95%进行平行试验，并测定出各组总黄酮浸出率，结果如图1所示。
图1 乙醇浓度对黄酮提取的影响Fig. 1 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction
由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，葛根中黄酮的浸出率增大，当乙醇体积分数增大至50%时，黄酮浸出率达到最高，为2.51%；之后随着乙醇体积分数的增大，黄酮浸出率逐渐降低。产生这一现象的原因与不同体积分数乙醇溶液的极性有关。根据相似相溶原理，当乙醇溶液的极性与葛根中黄酮的极性相近时，其浸出率最高。乙醇体积分数太低时，葛根黄酮浸出不充分，乙醇体积分数较大时，溶液极性降低，葛根中一些脂溶性成分溶出，抑制黄酮的浸出，葛根黄酮浸出率急剧降低，所以确定乙醇体积分数为50%。
3.2.2 料液比
固定超声时间为24 min，体积分数50%乙醇溶液为浸提液，在料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)试验条件下提取葛根总黄酮，并测定出各组总黄酮的含量。结果如图2所示。
由图2可知，料液比小于1∶30 (g/mL)时，葛根中总黄酮浸出率随着料液比的加大而增加；当料液比为1∶30 (g/mL)时，黄酮浸出率达到最高，为2.54%；之后随着料液比的增大，黄酮浸出率略有降低。这是因为料液比较小时，葛根中的总黄酮溶出不完全；料液比增大后，促进了葛根中总黄酮的溶出，料液比为1∶30 (g/mL)时，葛根中的总黄酮溶出达到饱和；再继续增大料液比，黄酮浸出率反而下降，造成溶剂浪费，所以确定1∶30 (g/mL)料液比为宜。
图2 料液比对黄酮提取的影响Fig. 2 Effect of material-liquid ratio on flavonoids extraction
3.2.3 超声时间
固定乙醇体积分数为50%，料液比为1∶30 (g/mL) ，选择超声时间分别为12、24、36、48、60 min的条件下提取葛根中的总黄酮，并测定出总黄酮的含量。结果如图3所示。
图3 超声时间对黄酮提取的影响Fig. 3 Effect of ultrasonic time on flavonoids extraction
由图3可知，随着超声时间的增长，葛根中总黄酮的浸出率增加，当超声时间延长至36 min时，葛根中总黄酮的浸出率达到最大，为2.60%；此后随着超声时间的延长，葛根中总黄酮的浸出率逐渐减小。这是因为超声时间较短时，葛根中的总黄酮并未完全浸出；当超声时间为36 min时，葛根中的总黄酮浸出充分；再继续延长超声时间，使葛根中的其它非黄酮类物质也被浸出，且超声时间过长，浸出的黄酮类物质成分会发生降解，从而导致葛根中总黄酮的提取量减少。因此选择超声时间为36 min。
3.3 正交试验
根据“2.5”项试验设计进行3因素3水平的正交试验，试验结果如表2所示。
表2 正交试验结果
分析表2实验数据可得，影响超声波辅助法提取葛根中总黄酮的因素大小顺序为A>C>B；该法提取总黄酮的最佳条件为A1B1C3，即乙醇体积分数35%，超声时间24 min，料液比1∶40 (g/mL)，葛根中总黄酮的浸出率达到最高。
3.4 最佳工艺条件验证
由上述“3.3”项得知，当乙醇体积分数为35%，超声时间为24 min，料液比为1∶40 (g/mL)时是超声波辅助提取普洱葛根中总黄酮的最佳工艺。在此条件下，进行3次验证试验，葛根总黄酮的提取率分别为2.76%，2.79%，2.73%。平均为2.76%。此结果高于最佳单因素组合和正交试验中所得数据，说明该条件为超声波辅助提取葛根中总黄酮的最佳工艺。
4 结果与讨论
我国葛根分布广，葛根中的黄酮类物质有着较高的药用价值，如何高效、快速、低成本、低耗能地提取葛根中的总黄酮成为人们研究的焦点。提取葛根总黄酮的传统方法普遍存在耗时长，效率低和耗能高等问题，而超声波辅助提取法能有效弥补传统提取方法。本实验以乙醇作为提取溶剂，研究了乙醇浓度、超声时间和料液比3个因素对超声波辅助提取葛根中总黄酮提取的影响，并且采用正交试验对提取工艺进行了优化。实验结果表明，最佳提取工艺为乙醇体积分数35%，超声时间24 min，料液比1∶40 (g/mL)，黄酮浸出率最高，为2.76%。
