前交叉韧带重建术后腱骨愈合的生物学干预研究进展*

孙畅 郭亭 李林涛 赵建宁

（东部战区总医院骨科，江苏南京 210002）

前交叉韧带损伤是一种常见的韧带损伤[1]。前交叉韧带重建（anterior cruciate ligament reconstruction，ACLR）是前交叉韧带断裂的首选治疗，重建手术虽然恢复了前交叉韧带的解剖结构，但患者术后再次发生前交叉韧带损伤的几率是正常人的6 倍[2]，Ahmed等对200例ACLR患者进行长达20年的随访，发现重建术后患者再次损伤率为14.5%[3]。ACLR 患者的转归与重建韧带的腱骨愈合密切相关[4]，正常前交叉韧带腱骨交界的直接止点为4 层结构：韧带、非钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨[5]；重建韧带的腱骨愈合界面为间接止点，主要愈合过程包含骨道侧壁成骨、新生骨质塑形、腱骨界面血管重塑、Sharpey纤维出现、纤维软骨钙化等[6]。因此，大量学者就生物学强化ACLR的腱骨愈合进行了深入研究，以期加快腱骨愈合、缩短患者康复和回归正常运动的时间[7]。本文就ACLR 腱骨愈合的生物学干预进行综述，主要分为6个方面：生长因子、干细胞、基因治疗、自体组织、生物材料和药物。

1 生长因子

目前发现的参与腱骨愈合的生长因子包括骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、转化生子因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β 1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，g-CSF）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）。

BMP 是一种广泛存在于骨基质的糖蛋白，在骨形成和骨骼化中有重要作用，是当前唯一被认为拥有异位成骨能力的生长因子[8]。Jin 等在动物实验中发现羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）/BMP 组在组织学上有更多Ⅰ型胶原、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、BMP-2和Runx-2的表达；术后3周的组织标本H-E染色显示HAp/BMP组有更多的骨形成，Mason 染色在HAp/BMP 组的丝状骨架中发现有更多的成骨细胞、软骨细胞和胶原包裹[8]。王智等在兔前交叉韧带重建模型中发现ACLR 术后3个月进行Micro-CT 检测，相较于对照组和空白对照组，BMP-2 组胫骨骨隧道内有连续骨出现、腱-骨部再生明显；苏木精-伊红染色和Mason 染色也发现BMP-2 组骨道内肌腱有大量新生骨长入，BMP-2 组腱-骨交织紧密；提示BMP-2通过加强骨隧道骨再生和腱-骨结合部愈合促进腱骨愈合[9]。在动物实验中发现含有BMP-2活性的移植物可诱导获取更多的内源性BMP-2，从而促进股骨和胫骨骨道内的骨生成，最终增强重建ACL 的硬度[10]。Han 等也在鼠前交叉韧带损伤动物模型中验证了损伤区局部持续的BMP-2联合富血小板纤维蛋白可促进重建的ACL的肌腱和骨形成[11]。

VEGF可通过内皮细胞的活化、迁移和增殖促进新生血管的生成。Yoshikawa 等在动物实验中发现，VEGF 干预组较对照组有更多的新生血管和成纤维细胞浸润，但在12 周的生物力学检测中VEGF 干预组的移植韧带硬度和膝关节稳定性较对照组明显下降。由此可见，外源性VEGF会影响移植物的稳定性和硬度[12]。上述结果可能与外源性VEGF 的半衰期短有关系，Chen 等发现透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）可作为VEGF 的稳定载体，在动物实验中，VEGF/SH 组的微血管密度在ACLR 术后第2 周、4 周和8 周均高于对照组；生物力学方面，除第2 周短暂下降，第4周和第8周重建韧带的硬度和失效负荷均明显高于对照组[13]。Wei 等在动物实验中也发现，局部应用TGFβ1/VEGF 转染的骨髓间充质干细胞可明显加快重建韧带的血管化，从而加速韧带的重塑，在术后24 周重建韧带获得最佳的生物力学性能，提示TGFβ1 和VEGF 的交互作用可增强移植肌腱的生物力学活性，获得更好的重建效果[14]。

TGF-β1在韧带愈合过程中有重要作用，体外实验中发现TGF-β1 可通过诱导ACL 纤维母细胞增加胶原和非胶原蛋白合成，Yamazaki 等研究发现在实验狗术后3 周的重建韧带的拉力实验中，TGF-β1 组的移植物胫骨复合体的最大负荷明显高于无处理组和空白纤维蛋白组[（188.2±51.4）N，（86.7±36.5）N，（99.0±18.7）N]，而后两组间无差别；组织学方面，TGF-β1组的腱-骨界面可观察到更多的垂直胶原纤维连接[15]。王晓旭等将48 只新西兰兔随机分为A 组（腺病毒转染TGF-β1）、B 组（腺病毒转染GFP）、C 组（DMEM 组）三组，术后第4、8、12 周分别进行生物力学检测，A 组的失效负荷均明显高于B 组、C 组（P＜0.05），B组和C组的失效负荷无统计学差异[16]。

除上述生长因子外，EGF、g-CSF 和HGF 也对腱骨愈合有促进作用。EGF 在细胞实验中可促进纤维母细胞增殖。体内实验中，EGF 和TGF-β 处理组的实验狗自体移植肌腱硬度和拉力负荷明显高于空白对照组，移植肌腱的组织中可见更加成熟的细胞生成[17]。g-CSF主要是调节祖细胞向中性粒细胞分化，但Sasaki等发现在实验狗中，g-CSF处理组的移植肌腱术后2 周可观察到更多的Sharpey 纤维和血管化；术后4周g-CSF组胫骨骨道明显窄于空白对照组，对胫骨骨道和移植物进行实时PCR可检测到更高水平的VEGF 和骨钙素的mRNA 表达；生物力学方面g-CSF 组也明显优于空白对照组[18]。HGF 最先作为肝细胞的生长因子被发现，Nakase 等在兔的动物实验中发现其可促进ACLR 腱骨愈合。HGF 组的腱骨愈合区在术后4 周即可观察到Sharpey 纤维和板层骨，术后12 周HGF 组连接腱-骨区的直接止点已形成；术后2 周和4 周的生物力学检测HGF 组明显优于空白对照组[19]。

Sun等采集富含生长因子的人BMSCs培养液，将鼠ACLR模型分为培养液注射组、细胞培养基注射对照组和非注射组，在术后4 和8 周进行的micro CT 检查发现，培养液注射组较其他两组的股骨骨道、胫骨骨道和腱骨交界处骨道明显减小，骨体积/总体积增高；术后4 周和8 周组织染色，培养液注射组的胶原蛋白1较其他两组增多；生物力学方面，术后4和8周培养液注射组的抗拉力负荷明显高于其他两组[20]。

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）含多种生长因子，包括TGF-β1、成纤维细胞生长因子2、胰岛素样生长因子、EGF、血小板源性生长因子（PDGF）和VEGF，可促进细胞增殖、细胞迁移和组织血管化[21]。PRP可局部应用于肌腱移植物、腱骨界面和关节内，临床试验中应用广泛。Andriolo 等对PRP 在ACLR中的作用进行综述，结果显示虽然动物实验中PRP 在组织学和生物力学方面有促进移植物腱骨愈合的作用，但临床试验发现PRP对ACLR术后疼痛有减轻作用，未证实PRP 对腱骨愈合有促进作用[21]。Valentí Azcárate 等进行了目前样本量最大的临床RCT 研究，研究将150 例患者分为2 组不同浓度PRP的干预组和空白对照组，在影像学和临床检测中三组无明显统计学差异[22]。PRP 单独应用时容易受关节液作用而迅速流失无法发挥作用，陈宇等进行的临床RCT 研究发现，联合应用PRP 和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可促进ACLR 术后腱骨愈合，改善患肢膝关节功能[23]。陈宇等将56 例前交叉韧带损伤手术患者随机分为PRP 凝胶和MSCs联合组、PRP凝胶单一组，研究发现两组术后3、6、12个月胫骨隧道斜矢状面位最大层面直径均明显低于术前（P＜0.05），且术后6、12 个月联合组的胫骨隧道斜矢状面最大层面直径明显低于单一组（P＜0.05）；两组术后3、6、12个月膝关节的Lysholm 评分和IKDC评分明显高于术前相应评分，且联合组明显高于单一组（P＜0.05）。有关PRP 对腱骨愈合的作用尚需更多的研究明确其临床意义。

2 干细胞

干细胞分为多种，目前发现的促进腱骨愈合的干细胞有骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stem cells，BMSCs）、脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、脐带间充质干细胞、腱源 干 细 胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）和CD34+ACL血管源性干细胞。

BMSCs 是一种多能干细胞，具有自我复制和分化的能力，在骨髓中含量丰富。Lim等术前获取实验兔的BMSCs，设置BMSCs 组和空白对照组，发现BMSCs 组腱骨愈合区软骨和Sharpey 纤维出现的更多更接近正常的ACL组织；生物力学测试方面，BMSCs组在硬度和失效负荷方面均明显强于空白对照组[24]。Hur 等发现BMSCs 可明显降低兔重建的前交叉韧带骨道宽度，增加重建区的细胞生存和胶原沉积[25]。ADSCs 有分化为多种细胞的能力且较BMSCs 易于获取，Kosaka 等在实验兔中发现ADSCs 组相较于空白对照组，腱骨区可观察到更多的成熟细胞，Sharpey纤维出现的时间也较对照组早；生物力学方面，ADSCs组术后2周、4周的失效负荷均显著高于对照组（P＜0.05），ADSCs 组术后6 周的硬度也明显优于对照组（P=0.037）。术后8 周和12 周，虽然ADSCs 组的失效负荷和硬度优于对照组，但在统计学上无明显差异[26]。Kouroupis 等发现ADSCs 和iPSCs 均可诱导实验猪移植的人工韧带愈合并生成正常韧带样组织，而空白对照组的人工韧带移植后无效[27]。Eduard 等对ACL 损伤的足球运动员进行队列研究，20 例患者术中注射ADSC，19例未处理患者纳入对照组，术后1年的随访发现ADSC 干预组膝关节功能和重建肌腱的愈合得到明显改善，但统计学分析上两组无明显差异[28]。Jang 等发现脐带间充质干细胞可促进实验兔的ACL 腱骨区愈合，同时影响股骨和胫骨骨道的扩大[29]。Lui等在鼠ACLR实验中发现，在第2周和第6 周TDSCs 组的骨道骨密度和骨体积/总体积均明显高于对照组，TDSCs 组在第2 周的失效负荷和第6 周的硬度也明显高于对照组，移植韧带的早期愈合明显加快[30]。Mifune 等培育了一种CD34+ACL 血管源性干细胞，CD34+干细胞可迁移至移植肌腱，诱导VEGF 表达[31]。进一步的动物实验证实，CD34+ACL源性干细胞组在第2 周有更多的Ⅱ型胶原和大量胶原纤维生成，免疫染色也证实了CD34+干细胞有更好的成骨和血管生成能力；第4 周的微电子扫描发现CD34+组的移植物周围愈合更佳；第8周的生物力学检测也明显优于其他组[32]。Silva 等对BMSCs 进行了RCT，发现ACLR 术后第3 周对BMSCs 处理组和空白对照组进行磁共振检查，两组的腱骨中间区信噪比无统计学差别[33]。

3 基因治疗

移植肌腱局部应用生长因子作用时间短，而应用基因转染干细胞的技术可在移植区持续长久地释放生长因子，增强其作用效果。Martinek等在实验兔中发现，在第4 周腺病毒BMP-2 转染的移植肌腱腱骨结合区有大量软骨-骨基质样组织生成，第6 周更多的上述组织生成；腺病毒BMP-2 转染组和对照组移植韧带的硬度分别是（29.0±7.1）N/mm、（16.7±8.3）N/mm，失效负荷分别是（108.8±50.8）N、（45.0±18.0）N，差异有统计学意义[34]。Chen等发现碱性成纤维细胞生长因子或BMP-2转染的BMSCs 可促进ACLR 的新骨生成和增强移植肌腱的生物力学性能，同时转染BMP-2和碱性成纤维生长因子的BMSCs对腱骨愈合的促进作用优于转染任一单一生长因子[35]。朱乐全等将54 只实验兔随机分为实验组（腺病毒转染BMP-2 的BMSCs）、对照组（BMSCs）和空白组（无处理），术后4、8、12周分别获取标本进行组织学检测和生物力学检测，苏木精-伊红染色显示实验组、对照组腱骨愈合明显优于空白组，实验组腱骨愈合优于对照组；实验组的刚度和最大刚度明显高于对照组和空白组（P＜0.05）[36]。Kawakami 等在实验鼠中发现BMP-2 转染的ACL 源性CD34+细胞可促进腱-骨区的骨生成，移植肌腱的失效负荷显著高于对照组[37]。Maxim等利用超声介导的基因传递系统，在猪前交叉韧带重建区域传递编码BMP-6 的基因，增加局部BMP-6的聚集从而刺激重建区域的间充质干细胞分化，术后8周的Micro CT扫描和生物力学分析提示重建区域的骨整合和韧带强度明显改善[38]。Zhang等研究发现Runx2 过表达的ADSCs 可在裸鼠中促进骨生成，在兔的ACLR 模型中，CT三维重建和组织学检查发现Runx2 过表达的ADSCs 组可明显增强腱骨区的新骨生成，Runx2 过表达组移植肌腱失效负荷更大[39]。Li 发现转 染PDGF-B 的BMSCs 可促进实验兔移植肌腱的细胞浸润和胶原沉积[40]。车伟等将实验兔分为实验组（转染BMP-2 和VEGF165 的BMSCs）、对照组（BMSCs）和空白组(未手术)，分别在术后3、8和12周进行组织学观察和生物力学检测。实验组新生血管和成纤维细胞浸润优于对照组，并在术后12周出现典型的4层直接止点结构；实验组最大负荷明显高于对照组（P＜0.05）[41]。

4 自体组织

骨膜含有多能中胚层细胞，可分化为各种结缔组织和骨。Chen等首先研究骨膜对ACLR的意义，在36只实验兔中进行双侧ACLR，一侧移植肌腱用骨膜包裹一侧单纯进行ACLR，第12周进行组织学和生物力学检测，骨膜处理组检测结果在统计学上优于对照组[42]；在进一步的临床研究中，Chen 等在312 例患者的重建韧带术中进行骨膜包裹处理，至少2年的随访后发现患者术后Lysholm 评分和膝关节稳定性都很满意，术后骨道扩大较单纯ACLR 患者发生率低[43]。Dai 等在动物实验中发现，骨膜处理的人工韧带腱骨区的骨整合较对照组明显改善，可观察到更多的骨组织和Sharpey 样纤维，骨膜组的失效负荷也明显高于对照组[44]。

5 生物材料

有关ACLR 腱骨愈合的生物材料主要分为4 种：生物固定、生物包被、生物合成的骨替代物和骨传导材料。

5.1 生物固定

与钛界面螺钉相比，高纯度镁界面螺钉可促进螺钉周围骨形成和移植物矿化，抑制螺钉的腐蚀效应，而两种螺钉的生物力学检测无统计学差异[45,46]；提示镁界面螺钉可增强ACLR腱骨区的骨整合，促进腱骨愈合。Chou等发现应用可降解聚乳酸螺钉和聚乳酸聚乙醇酸共聚物纳米纤维膜于腱骨界面，可增加骨长入、减少骨道骨量丢失[47]。

5.2 生物包被

Kawai 等发现在实验兔中，与单纯聚酯移植物相比，几丁质包被的聚酯移植物可明显促进股骨骨道的骨生成和关节腔软组织生成，生物力学检测几丁质组的失效负荷明显高于对照组[48]。Li 等发现生物活性玻璃在实验兔中可促进人工韧带的腱骨愈合，术后12周的生物力学和组织学检测发现生物活性玻璃组的失效负荷和腱骨区骨生成量均明显优于对照组[49]。

5.3 生物合成的骨替代物

脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）是一种骨诱导剂，是含有BMP、胰岛素样生长因子、转化生长因子和成纤维生长因子等生长因子的胶原蛋白支架。Lovric 等在实验鼠中发现DBM 可促进腱骨区的新骨生成和重塑，在第4周和第6周DBM组的失效负荷明显高于对照组，差异有统计学意义[50]。Hsu等在实验兔中也发现了DBM 促进腱骨愈合的作用[51]。Hexter 对DBM 在腱骨愈合中的作用进行了系统性综述，纳入的8 个动物实验提示DBM 可诱导直接的肌腱纤维软骨止点生成，促进腱骨愈合[52]。Iorio等对纳米羟磷灰石移植物进行了临床随机对照试验，40例患者被随机分为两组（纳米羟磷灰石组和空白对照组）进行ACLR，早中期随访时对患者进行影像学评测，纳米羟磷灰石组在移植物的强度信号、腱骨界面和骨水肿重塑过程均明显优于对照组，但长期随访中两组无统计学差异[53]。

5.4 骨传导材料

磷酸钙是一种可吸收的骨传导生物材料，Huangfu 等在比格犬的ACLR 实验中发现磷酸钙组腱骨区更早出现Sharpey 纤维、纤维软骨和钙化软骨，术后4周的腱骨复合物的失效负荷也明显高于对照组[54]。更多的动物实验证实磷酸钙可促进ACLR 的腱骨愈合[55]，增加膝关节的稳定性[56]，与BMP 合用后可增强腱骨区的骨生成和腱骨复合物的生物力学性能[57,58]。Kuang 等在动物实验中发现锶可增强磷酸钙对腱骨愈合的促进作用[59,60]。Mutsuzaki 等对磷酸钙在人ACLR腱骨愈合的作用进行了临床RCT研究，将64例患者随机分组，磷酸钙组在自体肌腱的两端混合磷酸钙，磷酸钙组术后1 年骨道扩大明显小于对照组，术后2年膝关节稳定性和Lysholm评分明显优于对照组，差异有统计学意义[61]。Mutsuzaki等进行了进一步的临床试验，结果显示在90 例患者的RCT 试验中磷酸钙预处理的ACLR 对患者很安全，术后1年磷酸钙组患者的股骨骨道明显小于对照组，其他临床数据两组比较无明显统计学差异[62]。磷酸钙对ACLR 术后的腱骨愈合有促进作用，但尚需进一步的动物实验和长期的临床随访以明确其具体作用。

6 药物

Demirag 等研究基质金属蛋白酶（metal matrix metalloproteinase，MMP）对兔ACLR腱骨愈合的作用，对28 只实验兔进行双侧ACLR，一侧应用MMP 抑制剂（巨球蛋白），一侧进行单纯ACLR，术后第5 周MMP 抑制组腱骨界面Sharpey 纤维更多，滑膜液中MMP 减少，生物力学强度更大[63]。Lui 等就二磷酸盐在鼠腱骨愈合中的作用进行了系列研究，局部或全身应用阿仑磷酸钠可促进骨道矿化、减少骨道扩大和增强移植物的腱骨整合[64,65]。Bi等发现在实验鼠皮下间断注射甲状旁腺激素可改善松质骨的厚度和微结构进而促进腱骨愈合[66]。Oka 等在自体腘绳肌重建ACL的实验兔中分别用含低剂量辛伐他汀的明胶水凝胶和明胶水凝胶处理骨道，术后2周辛伐他汀组腱骨区组织的血管化和骨化较对照组明显，术后第2周和第4周辛伐他汀组的胫骨骨道显著小于对照组，局部低剂量应用辛伐他汀可增强腱骨愈合的血管化和骨化[67]。Zhang 等发现在兔ACLR 模型中，低剂量辛伐他汀微粒包裹的人工韧带组腱骨区骨化和血管化明显优于空白对照组和单纯人工韧带组；生物力学方面，辛伐他汀组第8周的失效负荷最大[68]。

综上所述，前交叉重建术后腱骨愈合是影响手术效果的重要因素，应用生物学技术可促进腱骨愈合。生长因子可促进腱骨界面的血管化、纤维软骨与骨的形成，PRP含有多种生长因子，干细胞、自体骨膜对生长因子有促进增强的作用，联合干细胞和生长因子的基因治疗可增加干细胞和生长因子在局部作用的时间和强度，生物材料可作为载体联合生长因子、干细胞等共同作用于腱骨界面，但本文大部分研究主要停留于动物实验阶段，目前进行的临床试验主要是PRP、BMSCs、ADSC、自体骨膜和部分生物材料，其中自体骨膜和生物材料促进腱骨愈合的作用在临床试验中已被证实，但尚需更多的临床试验和动物实验进一步验证生物学干预在腱骨愈合中的明确作用，以期为临床治疗提供帮助，加快前交叉韧带重建患者的康复，同时改善其生活质量。