脓毒症免疫抑制的监测和治疗进展

吴健锋

（中山大学附属第一医院重症医学科，广东 广州 510080）

1 概述

脓毒症（sepsis）是宿主对感染反应失调导致危及生命的器官功能障碍，是现代医疗条件下重症病人主要的死亡原因之一［1］。由于脓毒症的高发病率、高病死率、高治疗费用的挑战，全球发起了拯救脓毒症的运动，并制定更新了治疗指南［2-4］。2017年WHO将脓毒症确定为全球卫生优先事项，敦促各国降低脓毒症的全球负担［5］。脓毒症发病机制未明，宿主在脓毒症发生后的免疫功能抑制是影响预后的重要原因。免疫抑制导致患者无法抵抗原发性细菌感染和容易发生继发感染，院内病死率增加［6-8］，与再入院率和长期病死率密切相关［9-10］。因此脓毒症诱导的免疫抑制已成为目前的研究热点［6，11-13］。

2 脓毒症免疫抑制的监测

因为脓毒症具有很大的异质性［14］，目前尚没有脓毒症免疫抑制的统一诊断标准，可以通过临床早期识别免疫抑制的高危患者并加强免疫功能监测指导临床治疗［15］。

2.1 筛查高危人群

研究显示具有以下特点的患者是脓毒症相关免疫抑制的高发人群：①高龄、持续营养不良、长期服用免疫抑制药物或严重慢性疾病如慢性肾衰、慢性肝衰、肿瘤等患者是免疫抑制的高危人群；②免疫抑制患者更易发生一些条件致病菌或者低毒性菌感染，如不动杆菌属，单胞菌属或真菌［15］。

2.2 监测天然免疫功能受损判断脓毒症免疫抑制

2.2.1 中性粒细胞 中性粒细胞是天然免疫中十分重要的免疫细胞之一。机体受到病原微生物入侵时，中性粒细胞是感染早期最先发挥作用的免疫细胞。临床上发现脓毒症患者的中性粒细胞数目并不减少，甚至增多，但是未成熟的性粒细胞（CD10dim CD16dim）的比例显著增加［16］。可以使用中性粒细胞化学发光强度的方法评判中性粒细胞的杀菌活性，脓毒症患者的中性粒细胞化学放光强度明显降低，提示其杀菌活性的降低［17］。因此，通过检测中性粒细胞的表型改变和杀菌活性有助于识别脓毒症患者是否发生免疫抑制。

2.2.2 单核细胞 人类白细胞抗原（human leuko⁃cyte antigen-DR，HLA-DR）是抗原提呈细胞表面表达的MHC-Ⅱ类分子，目前许多研究都已经证实单核细胞表面HLA-DR（mHLA-DR）可以用来评判脓毒症患者免疫抑制的生物标志物，是目前监测脓毒症患者是否发生免疫抑制最重要的指标之一［11］。脓毒症患者mHLA-DR低表达与脓毒症患者的高病死率和继发感染息息相关，早期动态的监测mHLA-DR的变化有利于我们更及时的发现免疫抑制。进入ICU时间超过7 d的脓毒症病人发生继发感染的风险与mHLA-DR恢复速度密切相关，mHLA-DR恢复越慢，发生继发感染的风险越高［18］。脓毒性休克的患者发生院内感染病人mHLA-DR的表达均低于未发生院内感染患者，mHLA-DR的持续低表达与院内感染的发生密切相关。本课题组研究发现mHLA-DR表达是否可以在3～7 d内恢复到一定程度可以准确预判患者的预后［19］。mHLA-DR的表达还可以筛选脓毒症免疫抑制的患者并指导脓毒症的免疫治疗。Meisel等［20］研究采用GM-CSF作为免疫增强药物治疗脓毒症免疫抑制的患者，将mHLA-DR的表达量连续两天低于8000AB/C作为免疫抑制入组的标准，并把mHLA-DR≥15000AB/C作为治疗目标。

提取脓毒症患者外周血的单核细胞在体外用LPS刺激后检测其释放的细胞因子也有助于识别患者是否有免疫抑制。有研究证实脓毒症患者单核细胞在LPS刺激后，促炎因子TNF-α和IL-12的释放明显减少，而促进免疫抑制的IL-10释放明显增多［21-22］。临床研究中也采用这种方法验证脓毒症患者经过免疫刺激治疗后是否改善了免疫功能［20，23］。

共抑制分子（PD-L1）在单核细胞表达增加也可以作为免疫抑制的标志物［24］。PD-1/PD-L1通路是目前免疫抑制中十分重要的通路之一，而免疫抑制患者体内免疫细胞表面PD-1和PD-L1的表达显著增高。脓毒症患者发病后的3～4 d就已经出现单核细胞表面PD-L1表达的升高［24］，并且PD-1和PD-L1的表达升高与脓毒症的病死率、继发感染发生率呈正相关。

2.2.3 树突状细胞 树突状细胞（dendritic cells，DCs）是人体最主要的抗原提呈细胞。脓毒症患者第1天，外周循环中髓样DC（mDC）和浆细胞样DC（pDC）计数均明显低于健康对照。同时，与健康对照相比，脓毒性休克患者mDC和pDC表面的HLA-DR表达也均出现降低［25］。该研究中的43例患者中有10例发生了继发感染，mDC在第7天的计数在没有继发感染的患者中增加，而在随后发生继发感染的患者中仍然较低［26］。因此，动态的监测DCs细胞亚群的数目和功能也有助于识别免疫抑制。

2.2.4 NK细胞 NK细胞作为天然免疫的重要组成部分，NK细胞的计数在脓毒症患者会出现明显的下降，而NK细胞在淋巴细胞中占比较高的患者则会有较好的预后，同时脓毒症患者中提取的NK细胞分泌IFN-γ的能力显著受损［27］。

2.3 监测获得性免疫功能受损判断脓毒症免疫抑制

2.3.1 淋巴细胞 淋巴细胞计数是临床上很容易获得的一个指标，而持续的淋巴细胞数目减少也可以作为识别免疫抑制的生物标志物。一项回顾性研究发现［28］，脓毒症在感染后第4天，幸存者组的淋巴细胞计数明显高于非幸存者，严重的淋巴细胞减少（≤0.6×109/L）与继发感染的发生存在相关性，淋巴细胞减少是影响患者预后的独立危险因素。目前已经有临床研究将淋巴细胞计数小于900/mm3作为筛选免疫功能抑制病人的指标（NCT02797431、NCT02640807）。近期一项样本量近10万的大样本数据［29］显示淋巴细胞减少症与人群感染住院的风险增加以及感染相关死亡的风险增加有关。因此，淋巴细胞计数减少可以作为的简单易行的筛查脓毒症免疫抑制的方法。

2.3.2 T淋巴细胞 T淋巴细胞耗竭是造成免疫功能障碍的重要原因之一。而引起T淋巴细胞减少甚至耗竭的主要原因是源于细胞凋亡。对脓毒症患者的尸体解剖研究［8］发现，脓毒症患者脾脏内的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞显著减少，由T淋巴细胞分泌的IFNγ和TNFα也明显的低于非脓毒症患者。同时，死于脓毒症的患者体内CD4+T淋巴细胞表面存在PD-1的表达升高，相应的在巨噬细胞和内皮细胞表面也出现了PDL1的表达升高和HLA-DR的表达下降。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节，脓毒症患者CD4+和CD8+表面CTLA-4的表达会明显增加［30-31］。这些征象证实脓毒症患者在死亡前处在严重的T淋巴细胞耗竭和免疫抑制状态。在脓毒症中，T淋巴细胞的耗竭主要是CD4+T细胞和CD8+T细胞减少，而调节性T细胞（Treg）数目并没有减少，反而因为T淋巴细胞总数减少而造成比例增加。Treg细胞是一种抑制辅助性T细胞增殖和发挥免疫功能的T淋巴细胞亚型。目前，临床上常使用CD4+CD25+CD127-进行Treg细胞标记。在正常情况下Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例是5%～10%。一项对比脓毒症和全身炎症反应综合征的患者Treg细胞的研究［32］发现，在脓毒症早期患者体内Treg细胞占CD4+T细胞的比例明显高于对照组。T淋巴细胞耗竭和Treg细胞比例升高有助于识别免疫抑制患者。

2.3.3 B淋巴细胞 近年来，B细胞在脓毒症的炎免疫抑制中的潜在作用受到广泛关注。有研究［33-34］发现脓毒症患者早期即出现B细胞数目减少和耗竭，细胞凋亡是造成脓毒症患者体内B细胞数量减少的主要原因。并且不同亚型的B淋巴细胞也存在差异，其中记忆性B淋巴细胞凋亡要高于其他的类型。除了患者的B淋巴细胞数量减少，B淋巴细胞表面MHC-II表达降低，IL-10的分泌增加［33］。因此，B淋巴细胞数目减少和功能下降有助于识别脓毒症免疫抑制。

3 免疫增强治疗

严重的免疫抑制是造成脓毒症患者高病死率的主要原因之一。因此，我们可以通过上述办法评估脓毒症患者是否存在天然免疫和/或获得性免疫功能障碍来识别存在免疫抑制的高危患者，进而进行针对性的免疫调理治疗。

3.1 天然免疫增强的治疗

3.1.1 干扰素γ 干扰素γ（IFN-γ）是一种具有多种免疫功能的细胞因子。在体内，IFN-γ可以上调病原识别受体进而有利于抗原呈递细胞完成抗原信息的呈递，逆转脓毒症患者单核细胞的HLA-DR的表达降低。1997年一项纳入9例脓毒症患者的研究［23］发现IFN-γ可以通过刺激免疫细胞生成TNF-α增加和单核细胞mHLA-DR表达增加来逆转脓毒症中的免疫抑制。考虑到IFN-γ本身就是一种促炎因子，有可能导致严重的炎症风暴，需要特别注意其潜在的风险。目前一项纳入278例患者的IIb在研临床研究（NCT03332225，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03332225）将进一步证实其在治疗脓毒症中的疗效，免疫抑制评判的标准就是患者mHLA-DR表达连续两天小于30%。

3.1.2 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colo⁃ny stimulating factor，GM-CSF）是一种具有免疫刺激作用的生长因子，可以通过诱导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等多种免疫细胞的增殖和分化而发挥免疫调节作用。近年来，多项GM-CSF治疗脓毒症的临床试验相继开展［35-37］。Presneill等［35］针对脓毒症伴有呼吸功能障碍患者开展了一项小样本的临床研究。结果发现静脉使用小剂量GM-SCF治疗后，治疗组患者的氧合指数较安慰剂组改善更加明显，30 d生存率和器官功能衰竭数目的差异并无统计学意义。Orozco等［36］也将GM-CSF用于治疗非外伤腹腔感染的脓毒症患者，结果显示治疗组的抗生素使用时间和平均住院时间较对照组明显缩短，感染相关的并发症也有所减少，但两组在院内死亡率上未发现明显差异。2009年，Meisel等［20］将脓毒症合并免疫抑制状态的患者（连续两天mHLA-DR＜8000mAb/Cell）随机分为GM-CSF治疗组和生理盐水对照组。结果发现GM-CSF治疗组在治疗24h后所有的患m HLA-DR水平均明显上升，而对照组仅有15.8%的患者上升；同时，治疗组APACHE-Ⅱ评分下降更快，呼吸机使用时间、住院时间和ICU入住时间也明显缩短。2011年，Bo等［37］将12项GCSF和GM-CSF治疗脓毒症患者的研究进行了Meta分析，共纳入2 380例脓毒症患者，结果发现G-CSF和GM-CSF并不能改善脓毒症患者的28 d生存率，这可能与入组患者脓毒症发病时间不一、免疫状态不同相关。亚组分析发现，GM-CSF可以增加感染灶的清除。可见，过去临床研究并未发现GM-CSF可以改善脓毒症患者的预后，但其在增强病灶清除率和降低继发感染发生率上显现出一定的作用。

目前，一项大样本量的多中心，随机，双盲，安慰剂对照的在研临床试验（NCT02361528，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02361528）已经开始。这一研究将选择免疫抑制的脓毒症患者作为受试者，并且以28 d内ICU获得性感染发生率作为这项研究的主要终点事件。该试验旨在证实GMCSF对于感染病灶的清除和减少继发感染的疗效，其结果将会成为GM-CSF是否可以使脓毒症患者获益提供更加丰富的临床证据。

3.2 获得性免疫增强的治疗

3.2.1 白细胞介素-7脓毒症免疫抑制的机制之一就是淋巴细胞，特别是T淋巴细胞的凋亡和的耗竭。白细胞介素-7（IL-7）作为一种抗细胞凋亡的常见γ链细胞因子，对淋巴细胞的增殖和存活至关重要。它可以诱导活化和非活化T细胞的增殖，抑制其凋亡，从而逆转脓毒症病程中淋巴细胞的减少。

近期，全球第一项验证IL-7治疗脓毒症患者疗效的前瞻性，随机，双盲，安慰剂对照的Ⅱ期临床试验已经完成［38］。该研究纳入了27名脓毒性休克和严重淋巴细胞减少的患者。受试者随机接受重组人IL-7（CYT107）或安慰剂治疗4周，研究的主要目的是确定CYT107在脓毒症治疗中逆转淋巴细胞减少的能力及其安全性。结果发现CYT107治疗后绝对淋巴细胞计数和循环中CD4+和CD8+T细胞数目较基础状态增加3～4倍，是否能改善脓毒症患者的预后还需要更大样本量的Ⅲ期临床研究来进一步验证。

3.2.2 胸腺肽α1胸腺肽α1（Tα1）是一种天然分泌的小分子物质，主要由胸腺分泌。1972年，Goldstein等［39］首次从胸腺Ⅴ肽提取出Tα1。Tα1作为调节因子在天然免疫系统和获得性免疫系统中均可发挥作用。

目前，Tα1被用于治疗与免疫紊乱有关的疾病，包括乙肝病毒感染、某些癌症、以及作为疫苗强化剂。近年来中国已经进行了多项关于Tα1治疗脓毒症的临床研究［40］。2013年，我们完成了一项纳入361例脓毒症患者的多中心随机对照研究（ETASS研究）［41］，旨在探讨Tα1在治疗脓毒症中的疗效和安全性。所有患者被随机分配至对照组（n=180）或Tα1组（n=181）。治疗组接受7天疗程的治疗。结果发现Tα1与对照组相比，Tα1治疗组患者的mHLA-DR改善的更加明显，预后更好。2018年本课题组发起了一项胸腺肽α1治疗脓毒症的多中心随机双盲对照研究（NCT02867267，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02867267）目前正在募集受试者，预计纳入1106名脓毒症患者，希望通过这项大样本临床研究能够为Tα1治疗脓毒症的提供更加充分的临床证据。

3.2.3 免疫球蛋 白静脉免疫球蛋白（IVIG）可中和细菌内毒素和外毒素。SBITS研究［42］（n=624）和ESSICS研究［43］（n=218）是目前研究IVIG治疗脓毒症样本量最多的两项随机对照研究。这两项RCT研究的结果均证明IVIG并不能改善脓毒症患者的生存预后。Cochrane分别对免疫球蛋白IgG（IVIG）和免疫球蛋白IgM（IVIGM）治疗脓毒症分别进行了meta分析。在10项IVIG治疗的研究中共纳入了1 430例患者。结果发现IVIG组患者在28～180天的死亡率为29.6%，安慰剂组为36.5%（RR：0.81；95%CI：0.70-0.93）。在7项IVIGM的研究中（n=528例），IVIGM组28～60 d的死亡率为24.7%，安慰剂组为37.5%（RR：0.66；95%CI：0.51-0.85）。分析这些研究的偏倚和异质性风险发现，关于IVIG和IVIGM的meta分析的结果均存在中到高等的偏倚风险。现有的对于IVIG和IVIGM的研究大多数都样本量偏小、偏倚风险较高，几个大型的RCT研究都未能证明免疫球蛋白可以改善脓毒症患者的死亡率。因此，SSC指南不推荐对于脓毒症患者使用免疫球蛋白，需要更多高质量的临床研究来进一步证明它在脓毒症治疗中的疗效。

3.2.4 抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体 抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体作为抑制性免疫检查点的抗体能够恢复T细胞的功能，认为也可以用于治疗脓毒症免疫抑制患者。2019年两项I期临床试验［44-45］首次证实了抗PD-L1和PD-1抗体在脓毒症治疗中的安全性，患者耐受性良好，没有引起炎症风暴的发生。两类药物都有助于脓毒症免疫抑制患者mHLA-DR的恢复。评估其在脓毒症患者中的临床安全性和有效性还需要进一步证实。

3.3 中医药治疗

中医药是中国传统医学的重要组成部分，有多种药物已被初步证明具有提高机体天然免疫和获得性免疫的多靶点功效，这与脓毒症复杂的免疫抑制发病机制相契合。因此，中医药在脓毒症免疫调节中的作用正在被挖掘，结合临床研究，中医药提高脓毒症免疫功能的作用也逐渐被国际同行所重视［46-47］，但还需要更多严谨透彻的机制实验和高水平的临床研究进一步证实中医药在脓毒症免疫调节中的独特作用。

4 小结与展望

目前治疗脓毒症的标准方案是早期复苏、感染灶清除、抗菌药物使用和器官支持，但是在严格依照标准方案治疗后，脓毒症病死率仍然居高不下。随着我们对于脓毒症诱导的免疫抑制在器官功能损害和死亡中重要性的认识日益加深，围绕着脓毒症患者天然免疫和获得性免疫的监测和治疗的研究逐渐深入，出现了一种新的治疗模式——脓毒症免疫治疗。在这个全新的领域我们需要明确：脓毒症是一种多种病因引起的异质性较大的临床综合征，并不是简单的单一疾病！通过免疫治疗确定最有可能从中受益的患者，准确地监测免疫功能和治疗反应，从中筛选出合适的指标和治疗方案。