间充质干细胞源性外泌体抗炎免疫调节机制的研究进展*

周 娟， 熊 伟， 尹云玉， 修光辉， 孙 洁， 凌 斌

昆明医科大学第四附属医院重症医学科，昆明650032

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅能促进损伤组织的再生修复，还具有一定的抗炎及免疫抑制作用。然而，移植后的MSC存活数量有限，存活期短，定向分化为受损细胞起到直接修复作用的能力非常有限。而间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cell derivrd exosomes，MSC-Exo)通过携带各种生物活性因子(mRNA、microRNA、细胞因子、趋化因子、免疫调节因子等)，调节免疫细胞表型、功能和归巢，抑制炎症，对促进损伤组织修复起主要作用[1]。目前，MSC-Exo作为无细胞疗法逐步替代MSC，被广泛用于治疗各种自身免疫性及炎症性疾病，如：系统性硬化症[2]、自身免疫性肝炎[3]、炎症性肠病[4]、类风湿关节炎[5]、骨关节炎[6]、脓毒症[7]等。但是MSC-Exo抗炎免疫调节机制还不完全清楚，本文就近5年有关MSC-Exo抗炎免疫调节作用的基础及临床研究做一综述。

1 外泌体的概念与生物学特性

外泌体(exosomes)是一种细胞内吞来源的直径在30～100 nm之间的细胞外囊泡。于1983年首次于绵羊网织红细胞中被发现[8]，起初仅被看作是细胞清除代谢废物的手段未被重视，直到20世纪90年代末，研究发现外泌体可能是细胞间通讯的重要介质，才重新激起人们对外泌体研究的兴趣。外泌体细胞来源广泛，如：肿瘤细胞、内皮细胞、神经细胞、免疫细胞、肥大细胞、血小板以及干细胞等。外泌体携带与细胞来源相关的多种蛋白质、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞参与细胞活动的重要调控[9]。几乎所有外泌体都含有参与膜转运和融合的蛋白质(如Rab GTPases、flotillin、膜联蛋白)、参与多泡体生物合成的蛋白(如Alix、TSG101)、热休克蛋白(如HSP60、HSP70、HSP90)、四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81和CD82)等[10]。

2 MSC-Exo的生物学功能

MSC不同于其他细胞的特殊之处即具有强大的自我复制功能和多向分化潜能，具有低免疫源性和免疫调节特性，被越来越多地应用于自身免疫病动物及临床实验中[11]。MSC发挥免疫调节的具体机制还不是特别清楚，目前的观点：MSC通过旁分泌细胞因子，在细胞膜上表达连接蛋白Fas配体，与细胞直接接触导致活化的T细胞凋亡，诱导受体细胞免疫耐受以及改善自身免疫细胞表型而发挥作用[12-13]。

由于应用MSC存在很多不可忽视的问题，如生物安全问题、长期保存与运输问题、非治疗目的分化等[14]。基于以上亟待解决的问题，寻找替代干细胞的治疗途径显得尤为重要。最近几年研究人员把注意力转向一种特殊的旁分泌机制——外泌体[15]。相关研究显示，MSC-Exo具有源细胞的生物学特性、选择性组装、靶向性投递、高效修复受损组织、安全性高、化学性质稳定、易于保存等优点，作为运载MSC多种分泌产物的载体参与了MSC与损伤细胞之间的细胞通讯，起到关键信使的作用[16]。外泌体携带的酶以及化学物质可长期不被降解，无潜在毒性；PBS重悬后可于-80℃保存6个月，且生物化学活性不受影响，用于治疗疾病具有一定的安全性[17]。

MSC-Exo电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径约40～100 nm，密度为1.13～1.19 g/mL[18]。MSC-Exo内含多种蛋白质成分、MSC膜脂质成分，能与亲脂性染料PKH26结合，并表达MSC表面粘附特异性分子CD44、CD29、CD105及外泌体相关蛋白质，如CD9、CD63、CD81、Alix等[18-19]。应用Western blot法和流式细胞术检测外泌体表面蛋白标志物和特异性蛋白标志物可鉴定外泌体。目前，MSC-Exo主要通过超速离心法、超滤法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、色谱法及试剂盒法等方法分离并提纯[20-21]。超速离心法是目前外泌体分离的“金标准”，由于其提取的外泌体形态均匀，蛋白浓度高，并且纯度相对较高，不存在未知的潜在杂质污染，可以大量的提取，满足实验的基本需求，利于后续的实验研究，并且基于不同来源MSC-Exo的生物学特点，发明了各种不同改良方式，在实际工作中已被广泛运用。

虽然MSC来源不同(如来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐带等)，可将MSC-Exo进一步分为更多的亚类，但是它们所分泌的外泌体具有共同的特性。MSC-Exo通过携带不同的蛋白质、脂质和RNA(包括lncRNA、microRNA、siRNA、mRNA等)，将囊泡内的生物学活性物质转移至靶细胞，参与体内多种生物学活动，如免疫调节、抗炎、抗细胞凋亡以及促进细胞再生等[22]。

3 抗炎免疫调节功能

3.1 减轻炎症反应

炎症反应是多种疾病发生发展的重要机制之一，在炎症过程中损伤因子的释放造成组织和细胞的破坏，MSC-Exo通过携带各种抗炎相关细胞因子，发挥抗炎效应。研究表明，MSC-Exo可抑制TLR4-MyD88-NF-κB途径，降低炎症微环境中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12水平，升高抗炎因子IL-10、TGF-β水平[23]，改善心肌梗死、急性肺损伤、脓毒症等疾病的预后。炎症及缺血微环境加剧急性心肌梗死进程，血管生成在组织修复中起至关重要的作用，Teng等[24]研究发现，局部注射骨髓MSC-Exo，能明显降低梗死心肌的炎症细胞浸润及促进新生血管形成，恢复血流，改善心功能。人脂肪MSC-Exo通过携带高表达的miR-125a，促进内皮细胞血管生成[25]。脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后的炎症反应通过NF-κB途径诱导A1型神经毒性星形胶质细胞活化是加剧脊髓损害的关键，将骨髓MSC-Exo与星形胶质细胞共培养，可明显降低A1型毒性星形胶质细胞比例，静脉注射骨髓MSC-Exo，病灶中A1型星形胶质细胞比例及P65阳性细胞核比例明显降低，炎症因子TNF-α、IL-1β表达明显减少，而髓鞘碱性蛋白(MBP)，突触素(Syn)和神经元核(NeuN)表达则明显升高[26]。MSC-Exo的抗炎作用在Cosenza等[6]研究的小鼠骨关节炎模型实验中进一步被证实，实验结果显示，TGF-β3预处理的骨髓MSC-Exo有明显的软骨保护作用，可明显升高TGF-β3预处理的软骨细胞合成代谢标记基因ACAN、COL1、COL2B表达，降低分解代谢、炎症标记基因MMP-13、ADAMTS5、iNOS表达。miR-146a是众所周知的具有抗炎作用的microRNA，在MSC-Exo中高表达，调节靶组织IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1和CCL-5等炎症因子水平[27]。IL-1β预处理人脐带MSC，可明显上调外泌体中的miR-146a表达，降低外周血促炎因子IL-6、TNF-α表达，上调抗炎因子IL-10表达，改善肝脏、肺脏、肾脏的炎性损伤，降低脓毒症小鼠的死亡率[27]。骨髓MSC-Exo还高表达miR-223，传递到受损心肌，下调Sema3A和STAT3表达，降低心肌组织炎症因子水平，减轻脓毒症心肌损伤[7]。人脐带MSC-Exo通过抑制STAT3信号通路，使肺内miR-17表达上调，miR-204表达下调，降低促炎因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和缺氧诱导的有丝分裂因子水平，抑制血管重塑和低氧性肺动脉高压[28]。另外，将人脐带MSC-Exo注入炎症性肠病(IBD)小鼠体内，小鼠结肠组织和脾脏中IL-10、TGF-β基因表达增加，IFN-γ、TNF-α、IL-1β，IL-6、iNOS和IL-7基因表达降低，炎症性肠病严重程度明显降低[4，29]。

3.2 调节巨噬细胞表型及功能

在许多炎性疾病中，MSC-Exo有明显的抑制巨噬细胞活化的作用，诱导促炎表型M1向抗炎表型M2的转换。在心肌梗死模型中，骨髓MSC-Exo可通过激活NF-κB及AKT1/AKT2途径促进巨噬细胞M2极化，表现为CD11b、iNOS表达降低，CD206、ArgI表达升高，减轻梗死后炎症及心肌细胞凋亡[30]。Deng等[31]又发现，人脂肪MSC-Exo可通过激活S1P/SK1/S1PR1途径促进巨噬细胞M2极化，减少缺氧诱导的H9c2细胞凋亡及TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞纤维化，改善心肌梗死后的心脏纤维化和炎症反应。动脉粥样硬化是脉管系统的慢性炎性疾病，Li等[32]研究发现，静脉注射的骨髓MSC-Exo，可定向迁移到动脉粥样硬化斑块并选择性地在巨噬细胞附近聚集，通过miR-let7/IGF2BP1/PTEN途径大大减少巨噬细胞在斑块中的浸润，并且通过miR-let7/HMGA2/NF-kB途径促进巨噬细胞向M2极化，减少动脉粥样硬化斑块面积。肺泡巨噬细胞和浸润的单核细胞在肺部炎症和纤维化的进展中起着关键作用，Mansouri等[33]发现骨髓MSC-Exo可使单核细胞向免疫抑制及抗炎表型转化，对肺泡细胞进行分析，骨髓MSC-Exo可升高肺纤维化小鼠肺泡总巨噬细胞(CD45+CD11b-CD11c+CD64+)比例和非经典单核细胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR-2-Ly6clo)比例，降低促炎经典单核细胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR-2+Ly-6chi)比例。有趣的是，在骨髓细胞分析中也发现相同的结果，注射骨髓MSC-Exo预处理的骨髓来源的单核细胞也可明显改善肺纤维化的胶原沉积及炎症反应，使LPS诱导的脾源性F4/80+巨噬细胞低表达CD86、MHCⅡ及CD40，TNF-α释放减少，IL-10释放增加。IL-1β预处理的脐带MSC，可明显上调外泌体中的miR-146a，与巨噬细胞共培养后导致巨噬细胞M2极化，有效增强MSC的免疫调节特性[34]。在高氧诱导的支气管肺发育异常新生小鼠中，MSC-Exo同样可以调节巨噬细胞M2极化，改善高氧诱导的炎症及免疫异常[35]。此外，骨髓MSC-Exo还可使结肠炎模型小鼠巨噬细胞向M2极化，并使巨噬细胞进入结肠组织减少，维持屏障完整性，减轻结肠组织炎症反应[36]。

3.3 调节T细胞、B细胞功能

MSC-Exo可通过携带各种免疫调节因子(细胞因子、趋化因子和生长因子等)，影响B细胞、T细胞的活动，刺激血管生成，防止细胞凋亡，阻止氧化反应，调节炎症进程[37]。Matula等[38]在研究人脂肪间充质干细胞(AD-MSC)与T淋巴细胞的膜转运机制时发现，通过T细胞的纳米通道介导，AD-MSC掺入大量T细胞膜成分，继而分泌大量具有免疫调节作用的外泌体。Chen等[39]在研究骨髓MSC-Exo的免疫调节特性时发现，将骨髓MSC-Exo与外周血单个核细胞(PBMCs)共培养，可诱导辅助Th1细胞向Th2转化，外周血Th17细胞比例降低，调节性T细胞(Treg)及CD3+T细胞比例增加。MSC-Exo通过FasL诱导T细胞凋亡，或活化PD-1通路抑制T细胞活化，导致免疫耐受，介导CD4+T细胞转化为Treg细胞[40-41]。MSC-Exo使Th1细胞IFN-γ分泌降低，IL-4分泌增加，Th17细胞IL-17和IL-22分泌降低，IL-10的分泌提高，提示MSC-Exo调节免疫应答的复杂性和可塑性。Cosenza等[5]在研究MSC-Exo对类风湿关节炎及骨关炎模型的软骨保护作用时，发现MSC-Exo有明显的免疫抑制作用，将MSC-Exo分别和脾细胞分离的T淋巴细胞、B淋巴细胞共培养，结果发现MSC-Exo以剂量依赖性方式抑制T淋巴细胞增殖，并降低CD8+IFN-γ+、CD4+IFN-γ+T淋巴亚群百分比，增加CD4+IL-10+Th1调节细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比；降低与B淋巴细胞共培养上清液中总IgG水平，抑制B细胞分化为浆细胞，培养上清中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高，这种免疫抑制作用与MSC-Exo高表达TGF-β1、PGE2及IL-1RA有关。MSC-Exo具有抗原特异性的抗炎反应，在MSC-Exo处理的小鼠类风湿关节炎模型中，观察到免疫细胞Th1型向Th2型的转变，淋巴结中CD19+IL-10+Breg细胞亚群明显增加，IL-6、IL-1β水平降低。MSC-Exo抑制B细胞的增殖和向分泌免疫球蛋白的浆细胞的分化，外泌体中的CCL2直接抑制浆细胞分泌免疫球蛋白抗体[42]。为了评估MSC-Exo的免疫调节作用，在体外将骨髓MSC-Exo与外周血单个核细胞共培养，T细胞增殖率下降了1.65%，抑制作用与外泌体的量呈正相关，研究结果还显示人脐带MSC-Exo有更强的抑制作用[43]。Rahman等[44]研究发现骨髓MSC-Exo可携带高通量的miR-375，抑制PBMC的增殖，减轻1型糖尿病胰岛细胞移植免疫排斥反应，增强Treg细胞的功能，发挥免疫调节作用。

3.4 调节树突状细胞表型及自然杀伤细胞的增殖

树突状细胞(dendritic cells，DC)在免疫系统中起前哨作用，通过捕获受伤上皮的抗原被激活，活化的DC迁移至引流淋巴结，将抗原信息传递至T淋巴细胞，使T细胞活化，启动免疫应答，CD4+T和CD8+T细胞进一步分泌细胞因子或直接杀伤。Harrell等[45]在研究慢性气道炎症所致慢性阻塞性肺病(COPD)小鼠模型及临床样本时发现，运用生物工程产品“外泌体来源的多个同种异体蛋白”(exosome-derived multiple allogeneic protein paracrine signaling，Exo-d-MAPPS)处理小鼠可影响DC的迁移及抗原提呈特性，使具有免疫原性的成熟DC转变为免疫耐受型DC，DC表达CD80减少，分泌IL-12减少，分泌IL-10增加，进而影响CD4+Th1、CD4+Th17，CD8+CTL细胞的激活。另外，Exo-d-MAPPS还促进免疫抑制性IL-10产生，调节CD4+FoxP3+T细胞(Treg)增殖，从而减轻慢性气道炎症。和动物模型中观察到的类似，Exo-d-MAPPS治疗显著改善了COPD患者的肺部状况和生活质量。自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)在固有免疫和适应性免疫中起纽带作用，参与抗感染免疫、肿瘤排斥、自身免疫疾病的发病机制以及抑制耐受的维持。Ko等[46]在研究外泌体的抗肿瘤免疫机制时发现，与对照组相比，脂肪MSC-Exo处理肝癌模型大鼠后循环NKT细胞的百分比显著升高，此外，免疫组织化学检测也表明，肿瘤内CD8α+NKT细胞数量明显高于对照组，提示脂肪MSC-Exo可通过NKT细胞发挥免疫调节功能。研究表明，带有NKG2D配体的MSC-Exo能抑制NK细胞的毒活性，减少NK细胞及NKT细胞中炎性细胞因子(包括TNF-α、IL-1β、INF-γ、IL-17)产生[47]。胚胎肝MSC-Exo通过携带潜伏期相关肽(LAP)、TGF-β和血小板反应蛋白1(TSP1)，在NK细胞中诱导下游TGF-β/Smad2/3信号传导，抑制NK细胞的增殖、活化和细胞毒性[48]。骨髓MSC-Exo也可通过调节NK细胞，促进缺血后神经恢复和大脑重塑[49]。

4 展望

越来越多的证据表明，基于MSC的免疫抑制机制主要归因于MSC分泌的外泌体。MSC-Exo富含源自MSC的生物活性分子(mRNA、microRNA、细胞因子、趋化因子、免疫调节因子等)发挥调节免疫细胞表型、功能及归巢的作用[22]。本文我们着重介绍了有关MSC-Exo在减轻自身免疫和炎性疾病方面的治疗作用及分子机制的最新认识。目前研究显示，局部和全身施用MSC-Exo均可有效抑制炎症组织中有害的免疫反应，并促进受损实质细胞的存活和再生。MSC-Exo的抗炎作用依赖于炎症免疫细胞中免疫调节性miRNA和免疫调节蛋白的传递，使M1型巨噬细胞转化为免疫抑制性M2型巨噬细胞，DC向免疫耐受型转换，淋巴细胞Th1型向Th2型的转变以及产生更多的Treg细胞。外泌体有可能取代细胞疗法，缓解从血液、组织或骨髓获得干细胞移植治疗的压力，以MSC-Exo装载药物或基因治疗内容物可能最终会成为精确靶向治疗的工具[50]。但是，关于MSC-Exo产生和修饰以及外泌体质量和功能仍然需要我们更深入的了解，而且不同来源的MSC-Exo在传递可能增加或限制疾病的信号中的作用也需要更清楚的认识。为了进一步阐明MSC-Exo的免疫调节机制，需要利用蛋白质组学和高通量测序细化外泌体递送蛋白质及RNA种类及功能，进一步探索外泌体和细胞外囊泡之间免疫调节能力的差异。此外，MSC-Exo在进入临床应用之前还需要实施严格的标准化程序和有效的效价测定。