软骨组织工程种子细胞的研究进展

何爱娟 张天宇

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

种子细胞是软骨组织工程技术的关键要素，也是该技术实现临床应用转化的重要基础。早期的种子细胞来源主要有软骨细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)等；近年来随着细胞生物学的快速发展及研究者对各种细胞的深入理解，越来越多具有软骨再生潜能的细胞被尝试应用于软骨修复重建领域。然而这些不同来源的种子细胞有哪些生物学特性？其在软骨再生领域中又获得了哪些重要研究进展？更重要的是，这些细胞在临床应用转化中将会面临哪些挑战？哪些研究方向仍需进一步的探索？本文将针对这些问题展开综述，以期为软骨组织工程技术临床应用转化提供参考。

1 软骨细胞

软骨细胞是分化成熟的成体细胞，是软骨组织工程最早、最广泛应用的种子细胞。软骨细胞的分离培养技术体系最早建立于20世纪70年代[1]，此后有关软骨细胞的生物学行为特性及其在软骨再生中的应用陆续被报道。1982年，有学者[1]发现软骨细胞在体外扩增培养过程中极易出现去分化、软骨形成能力迅速丧失等现象，这无疑给软骨细胞的进一步应用带来了巨大挑战；但随后Aulthouse[2]和Mand等[3]发现利用三维培养、添加细胞因子等方法可使去分化的软骨细胞发生重分化、功能逆转，这些研究成果为解决软骨去分化问题提供了重要参考依据，从而推动了软骨细胞在软骨再生领域的进一步发展。近20年来，软骨组织工程修复技术已在动物体内取得较大成功[4-5]，且临床应用尝试也获得了较大进展[6-7]。

软骨细胞最早应用于关节软骨缺损的修复治疗。Brittberg等[8]最早报道利用可注射的自体软骨细胞复合软骨膜覆盖能成功修复骨关节炎患者的软骨缺损。经过2年随访确认有效后，美国FDA在1997年批准了这项技术的临床应用转化[1]。此外，Liu等[9]为减少获取骨膜后的继发组织缺损，尝试用软骨细胞复合聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架材料修复猪关节软骨缺损，并获得了成功。尽管这些研究在关节软骨修复重建领域中获得了较大进展，但仍未获得大规模的临床应用转化。主要原因在于软骨细胞的去分化、病理性肥大、骨膜增生、手术创伤大等因素影响了最终的软骨修复效果[1]。在耳再造领域，有学者[6-7]应用自体残耳软骨细胞在体外或体内构建了组织工程耳郭形态软骨，并成功重建了小耳畸形患者的耳郭。这是组织工程软骨在耳再造领域里程碑式的成果，但其体内的长期转归、形态维持情况、远期生物安全性仍需进一步验证。在鼻再造领域，Fulco等[10]应用自体耳软骨复合胶原支架材料体外构建的组织工程软骨成功修复了患者的鼻翼软骨缺损，重建了鼻部外形。在Fulco等[10]的研究结果中,尽管软骨体内再生并不理想，但再生组织能在体内长期存留并维持鼻部外形(能满足临床鼻重建的基本要求)，这为组织工程软骨的临床应用提供了重要参考依据。而在气管修复重建术中， Yang等[11]应用自体软骨细胞复合DegraPol 支架体外再生了成熟的长段气管形态软骨。Luo等[12]则应用兔耳软骨细胞复合PGA/PLA支架成功修复了兔的节段性气管缺损，且术后动物均能长期存活。这些结果说明组织工程软骨是气管修复重建的重要方向。尽管如此，节段性气管缺损在临床试用中尚未获得重大突破，这可能与气管上皮化、血管化等尚未有效解决有关[12]。除此之外，基于软骨细胞的组织工程软骨在眼再造、面部整形等领域均有试用研究[13-14]，这些结果为组织工程软骨的临床应用转化奠定了重要理论基础。

2 BMSCs

近年来，具有多向分化潜能的成体干细胞逐渐成为组织工程种子细胞研究的热点。BMSCs具有良好的软骨分化潜能[15-16]、可自体取材、体外增殖能力强，获取创伤小(可经骨髓穿刺获得)、无供区继发组织缺损、可重复取材等，这些优势使得BMSCs成为目前最有应用前景的软骨构建种子细胞[4-5, 17]。值得一提的是，BMSCs在皮下微环境中容易发生血管化、骨化，最终导致软骨再生失败[18-19]。为了解决BMSCs骨化问题，前期研究尝试将软骨细胞与其共培养，利用软骨细胞分泌抗血管化细胞因子的作用，抑制BMSCs血管化从而稳定体内软骨再生。由此可见，抗血管化是解决BMSCs皮下环境软骨再生稳定性的关键。应用载有抗血管化细胞因子的支架材料可能是解决BMSCs血管化的重要方向。然而，与皮下环境不同的是，关节微环境却十分适合BMSCs的软骨再生。Goldberg等[17]综述了1900～2015年有关关节软骨缺损修复的2 880篇文献，其中共有73篇文献应用了BMSCs进行人或动物的关节软骨缺损修复，且大部分研究均获得了较满意的软骨修复效果。He等[5]更是发现，应用BMSCs体外构建的组织工程软骨不仅能修复软骨缺损，同时还能修复骨缺损。这些结果说明，BMSCs可能是未来关节软骨缺损修复的理想种子细胞。

3 脂肪干细胞

脂肪干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells， ADMSCs)具有来源广、容易获取、能分泌多种细胞因子、具有多向分化潜能等特点，这些优势使其在修复重建领域获得了较为广泛的应用。Koh等[20]将骨关节炎患者自体的ADMSCs分离培养后注入关节腔内，随访2年后发现患者关节疼痛症状明显缓解，磁共振成像(magnetic resonance imaging， MRI)评分显著提高。Wang等[21]甚至将人来源的ADMSCs注入免疫完全且有骨关节炎的大鼠关节腔内，术后发现患侧关节具有良好的关节软骨再生；Feng等[22]将标记的异体ADMSCs复合透明质酸注入羊的关节腔内，术后14周观察到标记细胞在滑膜囊内存活，且MRI提示骨关节炎明显改善。这些结果初步证实ADMSCs不仅可促进关节软骨再生，且具有较低的免疫原性，这为异体移植修复提供了可能。尽管同种异体ADMSCs在关节修复重建领域获得了一定成功，但其体内长期转归如何仍需进一步研究。此外，同种异体细胞移植有疾病传播风险，其临床应用转化仍面临较大挑战。

4 胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)具有无限增殖和分化成各种终末细胞的能力，这是任何细胞都无法比拟的优势。大部分研究已证实利用细胞因子定向诱导、共培养诱导等方式可有效提高ESCs的体外成软骨率。Wang等[23]证实培养体系中添加细胞因子可提高人ESCs体外软骨再生率；McKee等[24]应用压力刺激联合三维支架材料促进ESCs体外成软骨。Zhang等[25]发现，将人来源的ESCs外泌体注入骨关节炎大鼠的关节腔内12周后，大鼠的关节软骨获得了较为理想的再生，且其骨关节炎症状明显好转。这些研究结果提示ESCs具有较强的软骨再生能力。尽管如此，目前ESCs在软骨再生领域的研究仍处于初级阶段，有关ESCs的调控分化机制至今尚未明确。更重要的是，ESCs主要来源于胚胎，且具有自发成瘤风险，内移植后的免疫排斥反应问题、成瘤问题、疾病传播风险等均是其临床转化的障碍。

5 诱导多能干细胞

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是利用反转录病毒将Oct4、Sox2、Klf4等转录因子转入成纤维细胞后获得的具有无限自我更新能力、多向分化潜能的干细胞[26]。这些重编程细胞的功能与ESCs十分相近，是软骨组织工程重要的种子细胞来源。Diekman等[27]将大鼠成纤维细胞重编程获得的iPSCs进行体外软骨定向诱导，结果发现这些细胞群分化成了较为成熟的软骨样细胞。Ko等[28]发现,将人来源的iPSCs体外成软骨诱导后注入具有骨关节炎的裸鼠关节腔内12周后，动物的骨关节炎症状得到明显缓解，且组织学检测证实其软骨的健康状态显著优于对照组。这些研究结果为iPSCs在软骨再生领域的应用提供了重要的实验基础。由于成体干细胞(BMSCs、ADMSCs等)随年龄增长其活性及功能状态逐渐下降，iPSCs无疑为患者提供了重要的细胞选择方案。

6 经血源子宫内膜干细胞

经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)是近年发现的间充质干细胞。Meng等[29]在2007年首次报道了该细胞。MenSCs是从月经血或者子宫内膜中分离获得的细胞群。他们发现这些细胞高表达CD9、CD29、CD41a、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105等干细胞表面标记物，倍增次数可超过68次，且具有较强的成骨、成软骨、成脂能力，这些特性均符合BMSCs的基本特性。此后有关MenSCs生物学特性的报道陆续出现。有文献[30-32]报道MenSCs比BMSCs具有更旺盛的增殖能力、更强的多向分化潜能、更低的肿瘤形成风险。Wolff等[33]证实MenSCs 在成软骨诱导液中培养21 d后形成了软骨样细胞团块，并表达软骨特异性细胞外基质如糖胺聚糖、Ⅱ型胶原蛋白等。Patel等[34]进一步证实MenSCs具有明确的软骨分化、骨分化、脂肪分化潜能。这些结果提示，MenSCs可作为软骨组织工程的候选种子细胞。但MenSCs的软骨再生能力如何？与软骨细胞、BMSCs等相比，其形成能力有无差异？体内软骨再生稳定性如何？长期转归如何？这些与临床应用转化密切相关的问题仍需进一步探讨。

7 展望

尽管软骨组织工程再生技术的应用研究已获得诸多进展，但种子细胞的来源问题仍是软骨组织工程的重要瓶颈。软骨细胞是目前最成熟、应用最广泛的种子细胞，但其在去分化问题、获取后继发组织缺损等仍是临床转化面临的重要挑战。因此，明确软骨细胞生理状态下的发育及分化机制，应用软骨细胞的发育机制优化体外培养扩增体系可能是避免软骨细胞去分化、稳定其细胞表型的重要方向。而为避免获取种子细胞造成的继发供区组织缺损，BMSCs、MenSCs等是较为理想的候选细胞。尽管BMSCs在关节微环境中软骨再生稳定，但其在皮下环境的骨化问题仍是限制其临床转化的重要瓶颈。深入探讨BMSCs骨化机制、软骨细胞抑制BMSCs骨化机制是解决BMSCs在皮下环境骨化问题的切入点。尽管ADMSCs、MenSCs来源广、易获取，但其软骨形成能力是否能满足临床应用需求仍需进一步验证，其体内长期稳定性和安全性如何仍需大量的大动物及临床试用研究。iPSCs、ESCs等细胞具有强大的软骨再生能力，但其人体内的生物安全性仍需进一步验证，此外临床转化所面临的伦理问题也需解决。综上所述，前期研究成果为软骨组织工程的临床应用转化提供了重要的实验基础，但这些种子细胞在临床应用转化前仍有诸多科学问题需阐明。