生物有机肥和化肥配施对冬小麦产量及土壤生物指标的影响

黄媛媛，马慧媛，黄亚丽,2，邢慧珍，3，徐炳雪，贾振华，郑立伟，4

(1.河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北科技大学 环境科学与工程学院，河北 石家庄 050018； 3.河北工业大学 化工学院，天津 300130；4.河北经贸大学, 河北 石家庄 050061)

施用化肥在我国粮食增产、稳产方面发挥了重要作用，但是长期施用化肥也造成了土壤肥力流失，引起土壤碳素过量消耗、有机质含量降低、理化性状恶化等问题，严重影响了农产品的产量和品质[1-3]。随着土壤生态环境的恶化，单施化肥已经难以维持我国农业的可持续发展。生物有机肥是在普通有机肥基础上添加了多种有益微生物菌群的一种新型肥料[4]。施用该类肥料不仅能够活化土壤养分、降低化学肥料用量、提高农产品品质，还可以培肥地力、改善土壤微生态环境，已经成为一种公认的可再生、环境友好型植物营养[5-7]，对2020年我国实现化肥施用量零增长具有十分重要的作用。近年来对生物有机肥的施用效果进行了大量的研究，结果表明，生物有机肥在黄瓜[8-9]、西瓜[10]、葡萄[11]、烤烟[12-13]、玉米[14]等多种作物上施用，均具有提高农作物的产量和品质的作用。生物有机肥还能够培肥地力、增加土壤酶活性、提高土壤有机质含量和氮、磷、钾等营养物质的利用率[15-17]。曲成闯等[18]研究表明，施用生物有机肥可提高黄瓜种植土壤不同土层的土壤肥力水平和酶活性，且随生物有机肥用量的增加而增加。微生物是土壤活性的重要指标，近期越来越多的研究表明，施用生物有机肥还具有调控土壤微生物群落结构、改善土壤微生态多样性的作用[19-20]。罗佳等[19]的研究结果显示，生物有机肥和化肥配施能够提高土壤中细菌的香农-威尔指数，增加土壤微生物多样性。土壤微生物多样性的增加对土壤中病原菌的数量、土传病害的降低具有一定的作用。生物有机肥和化肥配施不但可增加土壤中细菌、放线菌和芽孢杆菌的数量、减少真菌的数量，还可以增强土壤微生物生态系统的稳定性[17]。另外，由于生物有机肥中含有包括拮抗菌在内的大量有益微生物而对番茄枯萎病具有良好的防效[21]。

冬小麦是我国主要的粮食作物，但连年单一施用化学肥料造成土壤肥力下降、土壤微生态环境恶化、肥料利用率低、小麦产量和品质下降。利用生物有机肥具有改良土壤、增加产量的特性，将生物有机肥应用于冬小麦生产必将产生良好的效果[22-23]。然而，目前在大田作物冬小麦上探讨生物有机肥对化肥的适宜替代量、产量效果及对土壤生物指标影响等方面的研究尚不多见。本研究向黄淮海北部冬小麦-夏玉米种植区引进生物有机肥，以冬小麦土壤生物指标为重点研究对象，通过分析生物有机肥替代不同量化肥对冬小麦产量、土壤酶活性、微生物数量和多样性等指标的影响，确定适合黄淮海地区应用的冬小麦土壤培肥、微生态环境修复、化肥减量技术模式，为调整冬小麦传统施肥模式、降低化肥用量以及提高肥料利用率提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验区概况

试验于2016-2018年在河北省辛集市马庄乡保高丰农场(E115°31′12.73″，N37°80′49.38″)进行，为北温带半干旱、半湿润季风气候区，光热资源丰富，年平均气温12.5 ℃，平均降雨488 mm，供试土壤土质类型为轻壤质潮土，pH值8.11，有机质17.84 g/kg，全氮0.92 g/kg，有效磷、速效钾分别为19.94，118.32 mg/kg。

1.2 供试材料

供试化肥为沃利沃氮磷钾复合肥(N-P2O5-K2O为26-10-15)，由河南农心肥业有限公司生产；供试生物有机肥由河北瑞安康生物科技有限公司生产，其中功能微生物为枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，菌数为0.89×108cfu/g，pH值6.87。该生物有机肥中有效磷含量为164.28 mg/kg，全氮、全磷、全钾、速效钾、有机质含量分别为2.26%，3.24%，3.47%，3.16%，54.29%。

1.3 试验设计

试验设置5个处理，分别为：生物有机肥处理(T1)，生物有机肥用量4 500 kg/hm2；生物有机肥+化肥减量10%处理(T2)，生物有机肥用量4 500 kg/hm2，氮磷钾复合肥用量675 kg/hm2；生物有机肥+化肥减量30%处理(T3)，生物有机肥用量4 500 kg/hm2，氮磷钾复合肥用量525 kg/hm2；生物有机肥+化肥减量50%处理(T4)，生物有机肥用量4 500 kg/hm2，氮磷钾复合肥用量375 kg/hm2；常规施肥管理为对照(T5)，氮磷钾复合肥用量750 kg/hm2。本试验为单因素随机区组设计,3次重复, 共15个小区，每个小区面积100 m2。每小区设1 m双行样段2个,四周设有保护行。

1.4 样品采集

本研究采集2017，2018年的冬小麦收获期的土壤及小麦样品进行分析。

土壤样品采集：于冬小麦收获期采集各处理土壤样品，取样方法为五点取样法，采集5～15 cm新鲜土样并冰袋保鲜运送至实验室。采集的土样一部分4 ℃保存，用于耕层土壤可培养微生物数量的测定；一部分-80 ℃超低温冰箱保存用于微生物多样性测定；一部分自然风干，磨碎并过1 mm筛，用于测定土壤酶活性。

小麦样品的采集：于冬小麦收获期采集小麦样品。

1.5 测定项目和方法

土壤酶活性：采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行土壤磷酸酶活性、脲酶活性、纤维素酶活性的测定。其采用的方法分别为磷酸苯二钠水解比色法、靛酚蓝比色法、3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS)。

土壤可培养微生物：采用稀释涂平板的方法测定土壤中可培养细菌、真菌、放线菌的数量，其中细菌测定采用LB培养基，真菌测定采用PDA+200 U/mL庆大霉素培养基，放线菌采用改良高氏一号培养基+重铬酸钾0.01 g/L。

土壤微生物多样性：将采集样品送至生工生物工程(上海)有限公司，采用Illumina MiseqTM测序技术进行样品聚类和多样性分析。

小麦生长性状：于冬小麦收获期测量穗数、穗粒数、千粒质量、产量、株高、生物量。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2007与SPSS 18.0软件对土壤酶活性数据进行统计分析；利用Mothur软件对土壤微生物多样性数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同化肥替代量对冬小麦产量的影响

生物有机肥替代不同量化肥对冬小麦产量影响不同(表1)，其中T3、T2、T4处理的产量分别为6 510.65，6 237.30，6 084.15 kg/hm2，显著高于常规施肥处理(T5)和仅施用生物有机肥处理(T1)(P<0.05)。其中T3处理产量最高，比常规施肥处理增产13.42%。不同化肥替代量处理对小麦株高、穗数的影响基本与产量相同。结果表明，生物有机肥与化肥合理配施能够促进小麦营养生长、提高成穗数，最终达到提高冬小麦产量的效果，以生物有机肥+化肥减量30%(T3)处理的增产效果最为显著。但是T2、T3、T4处理与常规管理相比，对穗粒数、千粒质量的影响规律性不强，推测施肥管理主要是通过提高小麦的分蘖和成穗能力来改变小麦的产量，对穗粒数和千粒质量影响相对较小。

表1 不同施肥处理对冬小麦产量指标的影响Tab.1 The effect of different fertilizer treatments on yield of winter wheat

注： 同列数据后不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。表2-3同。

Note：Data with different lowercases in the same column indicate significant difference atP<0.05 level. The same as Tab.2-3.

2.2 不同施肥处理下冬小麦土壤酶活性的变化特征

2.2.1 不同施肥处理对冬小麦土壤碱性磷酸酶活性的影响 土壤碱性磷酸酶主要来源于植物根系和土壤微生物的分泌物，该酶特异性催化有机磷化合物水解为相应的醇和无机磷，对提高土壤磷素有效性具有重要作用。土壤碱性磷酸酶活性能够在一定程度上反映土壤中磷的利用率，由图1可知不同施肥处理土壤碱性磷酸酶活性在16.12～18.64 U/g，施用生物有机肥的各处理土壤碱性磷酸酶活性均显著高于常规施肥处理，土壤碱性磷酸酶活性分别提高了14.33%，15.60%，14.08%，9.12%，其中以生物有机肥+化肥减量10%(T2)处理酶活性最高，比常规施肥对照提高了15.6%；但是4个生物有机肥处理相比，土壤碱性磷酸酶活性差异不显著。说明在化学肥料减量施用或不施用的情况下，增施生物有机肥均能一定程度的提高冬小麦土壤中碱性磷酸酶活性，对于土壤固定磷库的活化、提高磷肥利用率起到一定的作用。

不同小写字母表示处理间差异达5%显著水平(P<0.05)。图2-3同。 Different lowercases indicate significant difference at P<0.05 level. The same as Fig.2-3.

2.2.2 不同施肥处理对冬小麦土壤脲酶活性的影响 脲酶是土壤中最活跃的水解酶类之一，能酶促土壤中尿素中酰胺C-N键的水解生成氨，对提高土壤氮肥利用率和土壤氮素代谢具有重要的意义。脲酶活性与土壤中微生物和有机质含量呈正相关。分析不同施肥处理下土壤脲酶活性结果(图2)可知，所有生物有机肥处理中土壤脲酶活性均显著高于常规施肥处理，脲酶活性分别提高了8.22%，7.22%，10.47%，5.41%，表明增施生物有机肥土壤中有机质含量和微生物数量的增加导致了脲酶活性的增加。进一步分析生物有机肥替代不同数量化肥处理的土壤脲酶活性发现，以T3处理的生物有机肥处理脲酶活性最高，与T2和T4处理存在显著差异，表明化肥和有机肥合理配施更利于脲酶活性的提高。由结果可知，增施生物有机肥有效提高了土壤脲酶活性，对提高冬小麦对氮素的吸收利用、提高氮素利用率、促进冬小麦生长有一定的作用。

图2 不同施肥处理对土壤脲酶活性的影响Fig.2 The effect of different fertilizer treatments on urease activity

2.2.3 不同施肥处理对冬小麦土壤纤维素酶活性的影响 纤维素酶是地球碳素循环中的一个重要的酶，催化土壤中植物残体的降解和转化，为植物生长提供缓效和速效营养。图3为不同施肥处理的土壤纤维素酶活性，结果表明，不同施肥处理之间，土壤纤维素酶活性存在一定的差异，其中T3 处理的纤维素酶活性最高、其次为T1和T4处理，再次为T2处理，这4个处理的纤维素酶活性均显著高于常规施肥处理T5，纤维素酶活性分别提高了63.89%，30.35%，66.45%，57.19%。其中，T3处理纤维素酶活性增加最为显著，高于T1和T4处理，但三者之间不存在显著差异。总体来看，对冬小麦土壤增施生物有机肥均不同程度提高了土壤纤维素酶活性，这对于还田冬小麦秸秆的快速降解、增加土壤有机质含量起着促进作用，并且在一定程度上提高了土壤肥力。

图3 不同施肥处理对土壤纤维素酶活性的影响Fig.3 The effect of different fertilizer treatments on the activity of cellulose activity

2.3 不同施肥处理下冬小麦土壤微生物的变化特征

2.3.1 不同施肥处理对冬小麦土壤中可培养微生物的影响 采集不同肥料处理的耕层土壤样品并进行土壤中可培养微生物的测定(表2)，结果表明,生物有机肥+无机肥减量30%(T3)处理土壤中细菌、真菌和放线菌和微生物总数4个指标的数量均最多，说明该处理耕层土壤中微生物生长繁殖最为旺盛，以常规处理的土壤微生物数量最少。不同处理间微生物的变化趋势为：生物有机肥+化肥减量30%处理(T3)>生物有机肥+化肥减量50%处理(T4)> 生物有机肥+化肥减量10%处理(T2)> 生物有机肥(T1)>常规施肥处理(T5)，表明单一施用化学肥料或生物有机肥均不利于土壤微生物的繁殖，化学肥料和有机肥料的合理配施使土壤中碳、氮比例协调，促进土壤微生物的生长繁殖。该微生物数量结果与土壤酶活性的变化趋势基本一致。

分析不同处理中细菌、真菌、放线菌的分布比例发现，不同处理的真菌、细菌、放线菌分布比例存在较大差别，其中以常规施肥处理(T5)的真菌含量最高，施用生物有机肥的T1～T4处理的细菌、放线菌含量则相对较高。总体而言，土壤微生物的数量和种类受施肥管理、植物生长状况等多种因素的影响，施用生物有机肥以及化肥减量改变了土壤中的营养成分及类型，从而造成土壤微生物的数量和比例在不同的肥料处理中存在较大的差异，土壤中的微生物由真菌型向细菌型过渡、土壤微生物含量和比例更趋于合理。

表2 不同施肥处理对冬小麦耕层土壤可培养微生物指标的影响Tab.2 The effect of different fertilizer treatments on soil cultivable microorganism of winter wheat

2.3.2 不同施肥处理对冬小麦土壤细菌多样性的影响

2.3.2.1 不同施肥处理对冬小麦土壤细菌多样性指数的影响 多样性指数是物种丰富度和均匀度的函数，是用来描述一个群落多样性的统计量，Shannon指数、Chao1指数和ACE指数是物种多样性常用统计指标。由表3可知，从Shannon指数来看，不同处理的Shannon指数的顺序为T1>T3>T4>T2>T5，其中T1、T3、T4 3个施肥处理的Shannon指数均显著高于常规施肥处理(T5)，T2和T5差异不显著，由此结果可以看出生物有机肥和化肥的合理配施使土壤中微生物的均匀度增加；Chao1指数和ACE指数呈现相同的变化趋势，表现出T3>T2>T4>T1>T5的顺序，T3、T2和T4 3个处理的Chao1指数和ACE指数最高，三者之间不存在显著差异，单施生物有机肥处理T1的Chao1和ACE指数相比其他生物有机肥生物多样性相对较低、而高于常规施肥处理(T5)。生物有机肥+化肥减量30%处理(T3)的Shannon 指数、Chao1指数、ACE指数分别比常规施肥处理(T5)提高了3.61%，19.74%，22.43%。由此可见，生物有机肥和化肥合理配施能够有效促进土壤中不同类型微生物的生长，提升土壤微生物丰富度和多样性。

表3 不同施肥处理对土壤微生物3种多样性指数的影响Tab.3 The effects of different fertilizer treatments on three indexes of soil microbial diversity

2.3.2.2 不同施肥处理下冬小麦土壤微生物的分类学组成分析 采用Illumina技术分析和鉴定了冬小麦收获期耕层土壤中的微生物菌群组成，从结果可以看出不同肥料处理间样品中的微生物无论在种、属水平，还是在科、目水平上菌群均基本相同，但是含量存在明显的差异。图4为不同施肥处理的菌群在目水平的分布情况，各处理的优势菌目均为鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)，各个处理中含量最大的是鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)分布范围为16.09%～21.70%，其中以常规施肥处理(T5)的含量最高，以生物有机肥+化肥减量30%(T3)处理含量最低，与T5对比，T3处理的优势鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)含量均降低。从排名前5位的优势菌群所占的百分比来看，施用生物有机肥的T1、T2、T3、T4 4个处理优势菌群所占百分比分别为34.32%，40.49%，33.28%，39.11%，均小于T5的42.20%，最大降幅为21.14%。表明增施生物有机肥、减施化肥具有平衡优势菌群含量的作用。

图4 不同施肥处理土壤中微生物在目水平上的菌群分布图Fig.4 Distribution barplot in order of soil microorganism under different fertilizer treatments

2.3.2.3 不同施肥处理间土壤中微生物菌群相似性分析 采用邻接法(Neighbor joining)对不同处理间微生物种群进行相似性分析，其中常规施肥处理(T5)和生物有机肥+化肥减量10%(T2)2个处理聚在一个分支上(图5)，表明化肥施用量较大的处理其微生物种群的相似性较大，进一步与只施用生物有机肥的处理聚在一个分支上，再次为T4处理，而T3处理的微生物单独归为一类，这说明生物有机肥和适当数量化肥的合理配施，是使微生物种群发生改变的重要因素，单施生物有机肥或化肥均不能取得最优效果。

图5 不同施肥处理土壤微生物目水平种群相似性分析Fig.5 The taxonomic composition of soil microorganisms in order under different treatments

3 讨论与结论

3.1 生物有机肥与土壤酶活

土壤酶是一类具有生物催化活性的特殊物质，参与土壤中许多重要的生物化学过程[24]，例如碱性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、纤维素酶是调控土壤物质循环的重要酶。土壤有机质和土壤微生物间形成良好的互利共赢关系, 并通过土壤微生物的生长代谢改善土壤酶活性[25]，与土壤理化性质相比，土壤酶活性能够更迅速的反映施肥措施对土壤肥力的影响。生物有机肥由于含有数目众多的功能微生物和大量的有机质，因此，施入生物有机肥势必对土壤酶活性造成一定的影响。胡诚等[26]的研究结果发现，土壤脲酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶活性与小麦产量及土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含量呈显著的正相关关系, 土壤酶活性高则土壤肥力高, 作物产量也高。本研究结果同样表明生物有机肥具有提高土壤酶活性的作用，单一施用生物有机肥或生物有机肥和化肥配施均能一定程度的提高土壤中碱性磷酸酶、脲酶、纤维素酶的活性。可以推测，良好的土壤微生态环境、适量的有机和无机营养是使土壤酶活呈现最优状态的必要条件。本研究生物有机肥中含有枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，这2株菌均是具有分泌有机酸和其他生物活性物质等多种功效的微生物菌株，这些微生物进入土壤后不仅自身在土壤中繁殖后分泌多种酶，而且这些微生物会通过改善土壤微生物菌群、增加土壤微生物多样性、促进植物生长、根系分泌，因而会分泌更多的酶。这一结果与陶磊、田小明等[27-28]研究得出的施用生物有机肥可不同程度提高土壤酶活性的结论相一致。土壤酶活性的提高使土壤中的营养元素处于相对活化状态，从而使冬小麦能够具有更好的生长环境，提高了冬小麦的产量，实现了保护环境和农作物增产稳产的统一。土壤酶种类很多，本研究仅以碱性磷酸酶、脲酶、纤维素酶为指标进行了酶活性的研究，其他研究表明施用生物有机肥还具有刺激土壤过氧化氢酶、蔗糖酶等土壤酶活增加的作用[29]。进一步分析不同施肥处理的土壤酶活性和冬小麦产量发现，无论从产量水平还是对土壤酶活性的促进方面，均以生物有机肥+化肥减量30%处理效果最为明显。可见，生物有机肥和化肥合理配施是提高土壤酶活性、保障农作物产量的重要措施。

3.2 生物有机肥与土壤微生物群落

微生物群落在土壤有机质分解和营养元素循环中起着至关重要的作用，微生物群落的数量、结构和活性与生态系统功能密切相关[30]。土壤微生物群落受诸多环境因素的影响，其中土壤有机质、氮素是影响土壤微生物群落组成的重要环境因素[31]，生物有机肥和化肥的施用能够通过影响土壤中的有机质和氮素含量进而改变土壤中的微生物群落。罗佳等[19]的研究表明，有机肥和化肥合理配施可以改变土壤的细菌群落结构，提高土壤微生物多样性。本研究通过稀释涂平板和高通量测序方法研究了施用生物有机肥对冬小麦可培养微生物及微生物群落多样性的影响。结果表明，施用生物有机肥处理的土壤可培养微生物总量、细菌及真菌数量升高，但是真菌数量占微生物总量的比例降低。土壤微生物群落的Chao1指数、ACE指数、Shannon 指数也均高于常规施肥处理，其中生物有机肥+化肥减量30%处理的Chao1指数和Shannon 指数最高，显著高于常规施肥处理。结果表明，生物有机肥和化肥的合理配施对提高冬小麦土壤微生物多样性和丰度最为有效。这主要是因为生物有机肥不仅本身含有益菌群能够在土壤中繁殖，而且生物有机肥基料含有丰富有机物和其他营养元素，可丰富土壤中微生物可利用营养，活化土著微生物，增加微生物数量[32]。李倩等[33]采用磷酸脂肪酸指纹图谱法分析了5 a定位试验情况下，增施有机肥、减施化肥对马铃薯种植土壤中微生物群落结果的影响，结果表明：增施有机碳类肥料能显著增加土壤细菌、真菌、放线菌以及土壤微生物群落的总生物量，与本研究结果一致。宋以玲等[34]的研究同样表明，化肥减量配施生物有机肥可以改善根际土壤微生物群落的数量和结构，而单一化肥的施入则使微生物种类减少，土壤微生态系统的稳定性降低。另外，本研究还进行了土壤微生物菌群分类学分析，虽然各施肥处理土壤中优势菌群的种类没有变化，但是与常规施肥处理相比，增施生物有机肥所有处理其优势种群的含量有所降低，前5个优势菌群占总微生物的百分比低于常规施肥对照，菌群结构发生了改变，说明施入生物有机肥会降低优势菌群在群落中的相对丰度。刘振香等[23]研究结果也表明，与无机肥相比，有机肥可提高土壤微生物多样性和丰富度，降低细菌群落中优势菌含量。可能是因为生物有机肥中含有的营养物质和微生物会促进土壤中多种微生物的繁殖，从而使优势微生物菌群所占比例反而相对降低。由这些研究结果可知，与其他经济作物相同，在冬小麦类大田作物上增施生物有机肥、减施化肥同样能够提高土壤微生物多样性，为冬小麦化学肥料减量和增产稳产提供了可行的施肥模式。另外，生物有机肥施用不仅能够增加有机质、土壤酶活性、微生物量等，还能够降低土壤中病原真菌的群体数量，从而降低农作物病害的发生[35]。本研究中所含的枯草芽孢杆菌是一种对立枯丝核菌、镰刀菌、赤霉病菌等多种病原真菌具有拮抗功能的微生物，其应用也有可能起到防治小麦病害的作用，但是本研究没有进行小麦病害发生情况的统计，还需要在此方面进行深入研究。

从冬小麦产量、土壤酶活性和微生物多样性等指标分析了不同生物有机肥和化肥配施处理的效果，研究表明，在冬小麦上底施生物有机肥4 500 kg/hm2、常规化肥减量30%时，冬小麦的增产作用最为明显；土壤中碱性磷酸酶、脲酶、纤维素酶分别比常规施肥处理提高了14.08%，10.47%，66.45%；另外，生物有机肥和化肥的合理配施也促进了土壤微生物多样性提高，土壤中可培养微生物的总量、细菌、真菌数量升高，但真菌占比降低。从土壤微生物的种群分析，生物有机肥和化肥合理配施使微生物多样性的Shannon 指数、Chao1指数、ACE指数均有所提高，导致土壤微生物中的优势菌群比例降低，含量较低的微生物含量有所升高。本研究结果表明，在华北小麦-玉米一年两熟种植区，冬小麦种植推荐增加施用4 500 kg/hm2的生物有机肥并替代30%化肥的施肥方案，该方案的增产效果、土壤微生态性状均最佳，达到了增产和改良土壤微生态环境的双重效益。但在今后研究中，对冬小麦品质、土壤养分利用情况以及成本效益等方面还需进一步综合考虑，以深入判断该技术推广的可行性。