m6A-RNA甲基化在非小细胞肺癌中的研究进展

袁婷莫碧文

作者单位：541004 桂林 1桂林医学院呼吸疾病重点实验室；2桂林医学院附属医院呼吸与危重症医学科

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占全部肺癌的80%，大部分患者就诊时临床分期较晚，常伴局部侵犯和远处转移，临床治疗效果并不理想，5年生存率低于20%［1-2］。既往研究显示表观遗传学修饰与肿瘤的发生发展密切相关，其主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控和染色质结构重构等方式对基因功能和表达水平进行调控，从而影响肿瘤的进展。表观遗传调控具有可遗传性和可逆性［3］，广泛参与调控肿瘤的多种恶性表型，并与其发生、发展和耐药密切相关，因此揭示表观遗传调控机制有望为肿瘤患者的早期检测、疾病监测及预后判断提供潜在的分子标志物［4］。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）-RNA甲基化是一种类似DNA甲基化或组蛋白修饰的表观遗传修饰方式，是由甲基化转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和相关阅读蛋白（Readers）共同调节的一种动态可逆的生物学过程［5］。目前研究显示，m6A-RNA甲基化参与包括NSCLC在内的多种肿瘤的发生发展过程，其主要通过影响mRNA的稳定性，调控肿瘤细胞增殖，影响细胞外基质或改变细胞上皮间质转化能力进而影响肿瘤细胞的转移和侵袭，可能是潜在的干预靶点［6］。本文就m6A-RNA甲基化在NSCLC中的研究进展作一综述。

1 m6A-RNA甲基化的概述

RNA甲基化研究是近年来表观遗传领域的前沿研究热点，其中m6A-RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰［7］，其主要富集于终止密码子附近和 3′-非编码区（3′-untranslated region，3′UTR）［8］，具有动态可逆、分布广泛以及修饰位点高度保守等特点。m6A的生物学过程主要由三种关键蛋白调控，即甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白。甲基化转移酶以复合物形式发挥生物学作用，主要催化mRNA上的腺苷酸而发生m6A修饰；去甲基化酶可对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰；而甲基化阅读蛋白则主要是识别发生m6A-RNA甲基化的碱基，从而激活下游的调控通路，如mRNA降解、miRNA加工等。甲基化转移酶和去甲基化酶在m6A-RNA甲基化中起到动态调节作用［9］。

m6A-RNA甲基化在干细胞的维持与分化、生物钟节律调控、肿瘤的发生发展、免疫调控、代谢性疾病等过程中发挥重要作用。GEULA等［10］在小鼠初发多能分化过程中发现，m6A-RNA甲基化作为分子开关的调控因子，可确保多能因子稳定性，而这是正确的遗传启动和干细胞分化所必需的。FUSTIN等［11］报道当m6A甲基化被抑制后，细胞质mRNA生物节律与稳态前体mRNA发生解偶联，从而特异性抑制甲基转移酶样3（METTL3），导致昼夜节律延长，RNA加工延迟。还有研究发现，METTL3介导的m6A-RNA甲基化可促进树突状细胞（dendritic cell，DC）的激活和功能成熟，树突状细胞中缺失METTL3基因可使其功能成熟受损，以及CD40、CD80和细胞因子IL-12表达下调，从而导致刺激T细胞反应的能力下降［12］。m6ARNA甲基化的动态改变还可影响信号分子和代谢通路相关基因的表达，从而影响机体的新陈代谢，其可以表现出不同的生理功能，而功能失调的m6A-RNA甲基化可导致多种疾病的发生，包括肥胖、糖尿病、代谢综合征以及癌症［13］。

2 RNA甲基化研究是近年来表观遗传领域的前沿研究热点，其m6A-RNA甲基化在NSCLC中的作用

RNA表观遗传修饰系统较复杂，m6A修饰酶既可以识别促癌基因也可以识别抑癌基因。既往研究显示，m6A-RNA甲基化在NSCLC发生发展中发挥重要作用，其甲基化相关因子可作为促癌因子（如ALKBH5）或抑癌因子（如 METTL3、FTO、YTHDF1、HNRNPA2B1、HNRNPC和eIF3等）在NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及细胞周期中发挥作用，可能成为NSCLC治疗的潜在的新靶点。

2.1 m6A甲基化转移酶

m6A修饰是由METTL3和甲基转移酶样14（METTL14）及其辅因子肾母细胞瘤1相关蛋白（WTAP）、RNA 结合基序 15（RBM15）、KIAA1429、ZC3H13 和METTL16组成的甲基转移酶复合物（Writers）催化的。其中，具有催化亚基活性的是METTL3，METTL14可与METTL3形成二聚体，而WTAP通过与RBM15、KIAA1429和ZC3H13结合形成复合体招募METTL3-METTL14二聚体至核小斑对底物进行甲基化修饰［14-16］。METTL3是m6A甲基转移酶系统中最主要的催化酶，可作为原癌基因或抑癌基因参与肿瘤发生、增殖、侵袭、迁移、细胞周期、分化等生物学进程［17-20］。目前，m6A甲基化转移酶在NSCLC中的作用主要集中于METTL3的相关研究。研究表明，敲低METTL3可抑制肺癌A549和H1299细胞存活和增殖，并且诱导细胞凋亡，同时也可以改变PI3K/AKT信号通路成员的蛋白表达和磷酸化，进而发挥抑癌作用［21-22］。在METTL3的SUMO化修饰介导的mRNA中，m6A的交替以及随后的基因表达谱改变可能直接影响肺癌H1299细胞生长［23］。此外，METTL3也可能以非m6A依赖性的方式影响NSCLC进展。JIN等［24］研究发现，METTL3通过与eIF3h相互作用，使mRNA环化，核糖体回收再利用的效率提高，从而增强了翻译效率，促进NSCLC的转移。该研究还发现抑制METTL3不仅可能成为治疗NSCLC的靶点，也可以增强化疗敏感性。由此认为，METTL3在NSCLC细胞中主要发挥促癌作用，可能是NSCLC潜在的诊断和治疗靶点。

2.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶主要有肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和烷烃羟化酶同源5基因（a-ketoglutarate-dependent dioxygenase alk B homolog 5，ALKBH5）均属于AlkB同系物家族，并被归类为2-氧戊二酸盐和铁依赖性核酸氧合酶［25］。FTO和ALKBH5主要对m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰，其中FTO是第一个被发现的m6A去甲基化酶，显示出对m6A的高去甲基活性，可影响代谢疾病和人类肥胖的发生［26］；而ALKBH5可催化去除核RNA（主要是mRNA）上的m6A修饰，进而影响核RNA输出、代谢和基因表达，甚至小鼠的生育能力［27-28］。然而目前研究显示，ALKBH5和FTO虽然同为m6A去甲基化酶，但两者在NSCLC的病理发展过程中却发挥不同的作用。其中，ALKBH5在NSCLC中主要发挥抑癌作用，而FTO在NSCLC中则可能发挥促癌作用。研究发现异常表达的ALKBH5可下调YTHDFs介导的Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）表达并抑制miR-107/LATS2介导的YAP活性，从而抑制NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化［29］。但是在肺鳞状细胞癌L78和 NCI-H520细胞中敲除FTO基因，却发现有效抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，而过表达FTO则促进其恶性进展［30］。在肺腺癌A549和H1299细胞中过表达FTO同样可观察到细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强，且m6A-RNA表达水平下调，因此推测FTO可能通过m6A去甲基化致使细胞迁移而促进肺腺癌进展［31］。LI等［32］在NSCLC组织和细胞系中也发现FTO过表达，而m6A含量降低，进一步在细胞中敲低FTO表达发现可抑制NSCLC细胞增殖，其作用机制可能与FTO的去甲基化酶活性有关。同时有研究［30］发现，FTO发生突变后其过表达并不能促进NSCLC细胞增殖和侵袭，说明FTO对NSCLC的致癌作用可能主要依赖于其催化活性。以上研究结果说明FTO在NSCLC中发挥促癌作用，抑制FTO可能延缓NSCLC进展。

2.3 m6A甲基化阅读蛋白

目前研究显示，m6A甲基化阅读蛋白主要作为促癌因子影响NSCLC增殖、迁移和侵袭。生物体中存在能与m6A特异性识别结合并介导其行使生物学功能的m6A阅读蛋白，包括YTH结构域蛋白1（YTH domaincontaining family protein 1，YTHDF1）、YTH结构域蛋白 2（YTH domain-containing family protein 2，YTHDF2）、YTH结构域蛋白 C1（YTH domain-containing protein C1，YTHDC1），核不均一核糖核蛋白 A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2B1，hnRNPA2B1）及核不均一核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，hnRNPC），真核起始因子 3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3），胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1（insulin-likegrowthfactor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）等，这些蛋白与 m6A 特异性结合后可介导RNA的选择性剪切［33］、细胞内定位和翻译控制［34］等RNA代谢过程。

SHI等［35］报道 YTHDF1 缺失可影响 CDK2、CDK4和cyclin D1的翻译效率而抑制NSCLC细胞增殖及肺鳞状细胞癌进展，而YTHDF1高表达与更好的临床结局相关。另有学者［36］检测50例NSCLC组织标本同样发现hnRNPA2B1在NSCLC中高度表达，且可与MGMT（甲基鸟嘌呤DNA-甲基转移酶）mRNA结合，认为hnRNPA2B1可能参与NSCLC发病。此外，hnRNPA2B1还也可通过特异性结合COX-2的核心启动子调节NSCLC生长［37］；hnRNPC过表达与较晚的临床分期及淋巴结和远处转移相关，且可促进 NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭［38］，其可能是通过激活IFN-α-JAK-STAT1信号通路发挥作用。

eIF3是最大、最复杂的翻译起始因子之一，由13个亚单位组成，如 eIF3a、eIF3b、eIF3d、eIF3h 等。其中，eIF3a是管家基因，与肺癌的发生和耐药性密切相关［39］。在NSCLC细胞中eIF3b呈高表达，且与疾病进展及不良预后有关，还能促进NSCLC细胞增殖，抑制细胞凋亡［40］。在NSCLC细胞A549和95D中敲低eIF3d也发现可显著抑制细胞增殖和集落形成，并阻滞细胞周期于G2/M期［41］。而这一作用可能是通过抑制整合素α5（integrin α 5）及肿瘤坏死因子受体超家族成员 21（tumor necrosis factor receptor superfamily member 21，TNFRSF21）表达或激活β-连环蛋白信号通路实现［42-44］。此外，有研究报道eIF3h与METTL3之间直接的物理和功能相互作用是增强致癌mRNA翻译、形成密集包装多核糖体和肺腺癌致癌性转化所必需的［45］。而有研究报道eIF3h蛋白在肺腺癌组织中高表达，eIF3h过表达促进肺腺癌细胞迁移和侵袭，这进一步证实了eIF3h是肺腺癌的致癌因素［46］。由此可见，在NSCLC中eIF3亚基主要表现为促进癌细胞增殖、迁移、侵袭和抑制细胞凋亡作用，有望成为NSCLC治疗的潜在靶点。

IGF2BP1是一种新型m6A阅读器，而IGF2BPs（IGF2BP1/2/3）作为一个独特的m6A家族读码器，可通过识别一致的GG（m6A）C序列靶向成千上万的mRNA转录［47］。分析癌症基因组图谱（TCGA）发现IGF2BP1在NSCLC组织中的表达水平明显高于癌旁组织，下调IGF2BP1可抑制NSCLC细胞增殖［48］。

3 小结

m6A-RNA甲基化在NSCLC发生发展中发挥重要作用，其甲基化相关因子可作为促癌因子或抑癌因子参与NSCLC细胞的生物学进程及化疗耐药，因此深入探讨m6A-RNA甲基化在NSCLC中的作用及其作用机制，以及m6A相关因子在NSCLC发生发展过程中的协同或拮抗作用，有望为NSCLC的诊断及治疗提供新的思路。