红腐乳发酵过程中菌群结构与风味相关性研究进展

张雅婷，孙娜，于寒松，朱先明，朱世杰，任大勇*

1(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春，130118) 2(长春市朱老六食品股份有限公司，吉林 长春，130500)

腐乳(sufu)又名豆腐乳、霉豆腐等，是一种利用微生物法改变植物蛋白风味的传统大豆发酵制品[1],至今已有一千多年历史。20 世纪50 年代前，酿造腐乳主要利用野生微生物培养毛坯；60 年代，应用纯毛霉菌种进行发酵培养；70 年代，应用曲类(红曲霉、米曲霉)参与后期发酵，称“曲系应用发酵期”[2]；80年代，食用菌类(蘑菇、平菇、猴头菇等)、花茎类(玫瑰花、桂花、生姜、人参)、曲类(豆曲、米曲、酱曲)、禽畜类(鸡、火腿、水产类虾子、虾仁等)应用于后期发酵,形成了各具特色的风味腐乳；90年代,开始发展多菌种(毛霉、根霉、曲霉、酵母、小球菌等)及复合酶制剂酿造腐乳,进入了“生物技术应用期”，为腐乳发酵技术的研究与发展奠定了理论基础。

由于后期发酵过程中灌制的汤料不同，形成了各具特色的风味腐乳，根据腐乳的风味可分为红腐乳、白腐乳、青腐乳等。其中红腐乳就是在汤料中加入了红曲、面曲等,使红腐乳呈现出鲜明的红色。在红腐乳发酵前期，主要是毛霉等微生物的生长发育期，豆腐坯周围布满菌丝，同时分泌各种酶，使豆腐中少量淀粉糖化和蛋白质逐步降解；发酵后期，毛霉、根霉与其他微生物共同发酵，经过复杂的生物化学变化，将蛋白质分解为胨、多肽和氨基酸等物质，同时生成一些有机酸、醇类和酯类等，赋予红腐乳特有的风味[3-4]。近几年，随着测序技术和组学理论的快速发展，对红腐乳发酵过程中微生物菌落结构的变化规律与产品风味之间的相关性有了更深入的了解，使得通过微生物调控技术来改善发酵工艺、提高产品风味稳定性成为可能。本文就红腐乳发酵过程中微生物对风味影响进行了综述。

1 腐乳中的微生物组成

由于地域和民族习俗不同，导致我国不同地区的腐乳使用的发酵菌种也有所不同。目前国内应用于腐乳生产的菌种大多为丝状真菌(毛霉、根霉)和酵母菌，也有少数腐乳使用细菌发酵[5]，如黑龙江克东腐乳使用藤黄小球菌作发酵剂。由于传统腐乳发酵是在开放式条件下进行的，除主要生产菌种外，还有其他微生物参与发酵[6-8](见表1)，因此造就了腐乳中微生物群落的复杂性和多样性。目前并不清楚这些微生物在腐乳发酵过程中所起到的具体作用，但有研究表明，这些复杂的微生物群落对腐乳风味的形成起着十分重要的作用。

1.1 腐乳中的微生物组成

1.1.1 毛霉

毛霉是腐乳生产过程中的常用菌种，用于腐乳生产的毛霉主要有五通桥毛霉、腐乳毛霉、总状毛霉、雅致放射毛霉、高大毛霉等。毛霉在腐乳生产过程中能释放丰富的蛋白水解酶及其他有益酶系[9]，在α-淀粉酶的作用下将豆腐中少量淀粉转化成糖；所含蛋白酶、肽酶可分解原料中的蛋白质，从而生成胨、多肽和氨基酸，是一种赋予腐乳营养和风味的重要途径[10-11]。此外，毛霉可在腐乳坯表层均匀覆盖 0.1～0.2 cm的嫩滑皮膜，赋予产品良好的外形及独特的柔糯、细腻、润滑的质地，提高了产品的感官品质。

1.1.2 根霉

用于腐乳生产的根霉主要有米根霉、华根霉、无根根霉等。根霉与毛霉同属毛霉科，亲缘很近，形态相似，分泌酶系类似。因此，这2种微生物在腐乳中的作用相似。不同的是，相比于毛霉适宜生长温度偏低、受季节性限制等特点，现用的一些根霉呈现耐高温的特性，在37 ℃环境下生长良好[12]。

1.1.3 酵母

酵母菌由于细胞内部含有丰富的酶系、蛋白质和维生素，被用作提高腐乳风味、缩短腐乳发酵周期的菌种。传统发酵需4～6 个月，添加酵母菌后，生产周期缩短为60 d[13]。此外，也可添加酵母发酵产物来改善腐乳的风味，如曾卫国等[14-15]在腐乳发酵中添加酵母抽提物，有效的提高了产品中的呈鲜味物质次黄嘌呤核苷酸(IMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)。

1.1.4 细菌

细菌型腐乳生产用菌大多为藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等。细菌在腐乳发酵过程中的作用与霉菌相似，利用细菌生长繁殖过程中分泌的酶使蛋白质分解，淀粉糖化。不同的是细菌发酵没有菌丝，不能在腐乳坯体表面形成坚韧细腻的菌膜，因此产品外形较差，成为制约开发细菌型腐乳的重要限制条件。但细菌的发酵能力强，分泌的蛋白酶等酶活力较高且积累量大，氨基酸生成率较高，最终赋予腐乳鲜美醇厚、后味绵长的风味[16]。

1.2 腐乳不同发酵阶段的微生物变化

腐乳发酵期间，前发酵中，白坯、晾晒期和腌坯期的微生物变化较大，其中菌落总数、芽孢杆菌数、乳酸菌数以及真菌数(毛霉，根霉等)都随着发酵时间呈上升趋势，分别达到5.10、5.01、4.94、4.54 lg CFU/g，在晾晒期，菌落总数、芽孢杆菌数和毛霉、酵母达到顶峰，分别为9.11、8.87、7.77 lg CFU/g，而乳酸菌数在腌坯期达到最大值8.28 lg CFU/g，之后由于食盐盐渍微生物数量明显下降，表明食盐对真菌及一些其他微生物有较强的抑制作用；当加入汤料进行后发酵时，细菌总数在早熟期(5～10 d)逐渐降低至约5.7 lg CFU/g，并在成熟10 d后稳定且稍微升高，蜡状芽孢杆菌保持在3 lg CFU/g以下，乳酸菌数逐渐降低至<2 lg CFU/g，在成熟20和30 d后，肠杆菌科和真菌降低至不可检测的水平[5,17]。

2 腐乳中的风味成分

风味是区别腐乳的一种重要感官特征，其研究对稳定产品质量和提高产品品质具有重要意义。卢靖等[18]利用固相微萃取法结合气相色谱-质谱法分析了腐乳发酵过程中的挥发性风味成分，结果显示腐乳中主要风味物质是酯类、酸类、醛类、酮类、醇类以及烃类；也有学者对不同品牌的腐乳风味成分进行了分析，结果均显示酯类、醇类、酮类、醛类和 烃类是腐乳生产过程中主要的风味物质[19-21]。这些风味物质在腐乳发酵时期起到至关重要的作用，本文对不同品牌和不同品种的红腐乳风味成分进行了总结，如表2所示。

注：“+”检出；“-”未检出。

2.1 腐乳不同发酵阶段的风味变化

2.1.1 酯类

酯类是通过有机酸和醇类酯化反应生成的，被公认为腐乳中最重要的风味成分，占挥发性物质种类总数的34%。白坯中检测出6种酯类物质，含量较低；经毛霉发酵形成毛坯后，增加到22 种，相对含量也随之升高；腌坯过程由于辅料加入，烃类、醛类等物质含量升高，酯类物质含量明显降低；后发酵阶段，坯体中蛋白质等大分子物质降解以及生成的产物与辅料中的化学物质的协同作用使酯类物质不断丰富，主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯等，为腐乳提供了果香味和奶油香味等风味[22-23]。

2.1.2 醇类

醇的种类和含量与外界添加有关，在腌制时常常添加乙醇来增加其种类和含量。红腐乳发酵过程中鉴定出12 种醇类物质(乙醇、戊醇、己醇和苯乙醇等)：白坯中仅有3种；毛坯和腌坯中由于真菌和细菌的代谢，醇类增多；后发酵醇类含量开始降低，因为其发生酯化反应或氧化反应生成酯类物质，赋予腐乳酒香味、玫瑰香味以及香草味等风味[24]。

2.1.3 醛类

醛类是通过氨基酸的Strecker降解以及酯类物质过氧化和降解2条途径产生的。腐乳中鉴定出的醛类主要有正己醛、苯乙醛、壬醛、反式-2-壬烯醛等。发酵前期白坯中醛类物质风味含量为69.55%，中期经毛霉菌株发酵后相对含量迅速降低至7.92%，后期发酵阶段则呈现不断增长的趋势，后期发酵36 d相对含量增长至16.7%。其中，正己醛含量高达51.45%；随着腌制与后发酵的进行，其含量先降低后升高，这可能与辅料的加入以及不饱和脂肪酸的氧化有关，赋予腐乳甜味、水果味、坚果味以及焦糖味等风味[25]。

2.1.4 酮类

酮类化合物是脂肪和氨基酸在毛霉分泌的酶系的降解作用或者是美拉德反应作用下产生的。腐乳发酵过程中酮类物质含量相对较低，主要有2-庚酮、甲基庚烯酮、2-壬酮、1-辛烯-3-酮等，赋予腐乳香辣味、桂皮味、花香味、草本味及水果味等[26-27]。

2.1.5 烃类

腐乳中烃类物质主要有烯烃和烷烃两大类，其中烷烃含量较低，贡献较小；烯烃类物质从白坯到毛坯，含量由6.52%降到3.2%，随着发酵时间的延长，其含量降至1.04%，可能是由于其化学性质不稳定易氧化造成的。其中蒎烯的松节油气味、异松油烯的松木树脂气味等，均对腐乳的风味有一定的贡献[28-29]。

2.2 不同品牌腐乳中的风味成分

地区的差异性导致环境中微生物的不同，产生不同的代谢产物导致风味物质各不相同。闫平平等[30]研究了鼎丰、王致和腐乳的风味成分差异性，其中王致和腐乳检出醛类11 种、酮类4 种、酯类24 种、醇类7 种、呋喃类1 种、吡嗪类2 种、其他类5 种；鼎丰腐乳中检出醛类15 种、酮类4 种、酯类27 种、醇类6 种、呋喃类1 种、其他类3 种。刘娜等[25]在测定红腐乳中挥发性风味物质中得出，咸亨腐乳中醇类4种、酯类13种、萜烯类5种、杂环类1种、醛类5种、烯烃类1种、酚类1种、烃类2种、酮类1种；老才臣腐乳中醇类6种、萜烯类18种、酯类11种、杂环类2种、酚类1种、醛类6种、酮类3种、烯烃类1种；王致和腐乳中醇类4 种、酯类14 种、萜烯类10 种、杂环类2 种、醛类5 种、酮类3 种、烯烃类 3种、酚类1 种、烃类1 种。图1比较了王致和、鼎丰、老才臣、咸亨4种腐乳风味，可以看出酯类、酮类、醛类、醇类为共有风味物质。

图2显示，共鉴定出63 种风味物质，其中酯类27 种(共有风味6 种：乙酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸乙酯、十六酸乙酯)、醇类9 种(共有2 种：1-辛烯-3-醇、苯乙醇)、醛类11 种(共有2 种：苯甲醛、3-甲基丁醛)、酮类6 种(共有1 种：2-庚酮)、杂环化合物2 种(共有1 种：2-戊基呋喃)、烃类8 种、酚类2 种，王致和腐乳中醇类含量达57.01%，高于其他3种腐乳含量，酒香最为明显；老才臣和咸亨腐乳中的风味物质(酯、醛、酮、酸等)含量相似，其中老才臣腐乳中萜烯物质含量(茴香脑)远高于其余3种腐乳含量，说明老才臣生产中使用辛香料用量要大于其余腐乳中的辛香料用量；另外咸亨腐乳酯类物质含量高于其余3种腐乳含量，甜香浓厚，这些区别使得4种腐乳香气各有不同。

3 菌群结构与风味物质的关系

腐乳发酵过程中，微生物通过合成代谢产生风味物质及其前体物质，并产生相关的酶将原料中的大分子物质转化为小分子风味物质。腐乳发酵过程中霉菌大量繁殖，酶系分泌活跃，能分泌各种酶系(蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、肽酶等)，蛋白酶和肽酶使大豆蛋白水解成短肽和游离氨基酸,游离氨基酸在腐乳风味中有巨大的贡献[7,31-32]，前发酵中白坯到毛坯阶段，谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及赖氨酸含量增长迅速，其中苯丙氨酸和亮氨酸代谢形成2-苯乙醇和3-甲基丁醇。脂肪酶可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应,在腐乳前发酵阶段，脂肪酶降解豆腐坯中粗脂肪的能力加快，在腌坯阶段由于辅料的添加使酶活力下降，游离脂肪酸生成速度随之下降，在后发酵期由于酶活力的回升和后酵时间延长，游离脂肪酸总量逐步增加，醇类(乙醇、2-苯乙醇和3-甲基丁醇)的添加与脂肪酸(亚油酸、棕榈酸、油酸)通过酯化反应形成相应的酯类(己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和癸酸乙酯等)，同时酸类物质也出现明显的增加[17,33-37]。

腐乳在前发酵阶段葡萄球菌属、未分类细菌和未分类的明串珠菌属占优势，随着发酵的进行，芽孢杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、链球菌属占主导地位。其中乳杆菌属、假单胞菌属都与脂肪酸类、酯类物质具有很强的相关性，因为这些菌在代谢过程中产生乙酸、丙酸、乳酸等，而这些酸又是长链脂肪酸和酯的合成前体物质，乳杆菌属在发酵过程中分解糖的能力较强，它消耗葡萄糖和果糖产生有机酸，其与乳酸呈正相关，同时乳杆菌属生长使环境偏酸，从而能够抑制腐败性菌的生长，在发酵过程中具有一定的防腐作用；乳杆菌和酵母菌协同代谢出可发酵糖，产生乙醇、乳酸、乙酸等产物并结合成乳酸乙酯和乙酸乙酯等呈香物质；部分乳杆菌属和明串珠菌属发酵后能转化糖生成双乙酰、乙酰甲基原醇和3-羟基丁酮等芳香成分；此外，有的乳酸菌可将蛋白质分解成肽和氨基酸，赋予食品独特的风味；假单孢菌属能分解蛋白和脂肪，产生一些风味前体物质，它属于严格的好氧菌，随着发酵的进行含氧量降低以及酸度增加，其丰度逐渐降低。芽孢杆菌属也与酯类物质有较强的相关性，芽孢杆菌属在发酵过程中丰度不断降低，因为芽孢杆菌多为好氧菌，在发酵前期氧气量充足的情况下能够很好生长，随着发酵进行，含氧量降低逐渐抑制了芽孢杆菌的生长，丰度逐渐下降，而且发酵后期酒精度升高也会抑制芽孢杆菌的生长，芽孢杆菌属在腐乳后发酵阶段产生醇类、酯类等风味物质也是腐乳重要的组成风味；四联球菌与胍基乙酸盐，苯丙氨酸，色度和pH显著相关；假单胞菌与2种碳水化合物(葡萄糖和阿拉伯糖)和8种含氮化合物(谷氨酸，丙氨酸，高丝氨酸，胍基乙酸，天冬氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸和焦谷氨酸)以及pH显著相关；链球菌与6种碳水化合物(甘油，阿拉伯糖，乙酸，核糖，果糖和乳酸)和8种含氮化合物(谷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，苏氨酸，胍基乙酸，天冬氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸)以及色度和pH显著相关[16,38-40]；图3清楚的表明腐乳发酵过程中风味物质的变化主要与细菌和霉菌有较强的相关性，同时腐乳菌群结构也是影响风味物质变化的本质原因。

4 展望

当前对不同地区、不同品牌腐乳中的菌群结构与风味物质间关系的研究已经成为热点，但仍有诸多问题亟待回答，如腐乳体系中独特的菌群结构是如何形成的，又是如何影响产品风味的？有哪些微生物起到了关键的成味作用？不同微生物间的互作机制是什么？腐乳基质条件下核心微生物的代谢途径是否有别于其他环境？对于这些问题的探索将有助于开发优良发酵剂，实现定向利用微生物调控技术提高产品品质和稳定性，从而为开发传统腐乳产品工业化生产新技术奠定基础。