葛仙米化学成分及生理活性研究进展

易思富，田云，*

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；2.常德炎帝生物科技有限公司，湖南常德415707）

葛仙米是一种属于蓝藻门（Cyanophyta）、蓝藻纲（Cyanophyceae）、段殖藻目（Hormogonales）、念珠藻科（Nostocaceae）、念珠藻属（Nostoc）的低等单细胞蓝藻，俗称天仙米、天仙菜、水木耳、田木耳、珍珠菜，学名为球状念珠藻（Nostoc sphaeroids kützing）[1]。葛仙米的食用历史悠久，相传东晋时期葛洪在灾荒之年采之为食，偶获健体之功能，随后葛洪入朝将之献给皇上，体弱太子食后病除体壮，皇上为感谢葛洪之功赐名为“葛仙米”，并沿用至今。

葛仙米藻体呈胶质状、球状或其它不规则形状，颜色为蓝绿色或黄褐色；细胞球形，一般由多数细胞连成念珠状群体，外包胶质。葛仙米一般生长在水稻田、浅水池沼湖、溪的砂石间或阴湿的泥土中。目前世界上野生葛仙米的分布已十分稀少，产量很低，湖北省鹤峰县走马坪镇是我国葛仙米的主要分布地。葛仙米在我国已有1500 多年的食用和药用历史，据《本草纲目拾遗》记载：葛仙米，出勾漏草泽间。采得曝干，仍渍以水，可作羹入馔，味甚鲜；初取时如小鲜木耳，紫绿色，以醋拌之，肥脆可食，干则以水浸之，与肉同煮，作木真味。另据《全国中草药汇编》（第2 版）介绍，葛仙米“淡、寒，清热、收敛、益气、明目，主治夜盲症、脱肛；外用治烧烫伤”[2]。现有研究表明：葛仙米中含有蛋白质、氨基酸、多糖、脂肪酸、多种维生素以及矿质元素等营养成分和活性物质[3-27]，具有如抗氧化、抑菌消炎、增强免疫、抑制肿瘤、调节胆固醇代谢以及抗凝血等生理活性[28-43]。2017 年，湖南炎帝生物工程有限公司向国家卫生健康委员会提交了关于球状念珠藻（葛仙米）（卫食新申字（2017）第0009 号）的行政许可申请，根据《食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》，经国家卫生健康委员会审查通过（卫食新通字（2018）第0001 号）并已公告（国家卫生健康委员会卫生行政许可公告2018 年第10 号），葛仙米正式列入国家新食品原料名录[44]。本文在此基础之上，系统综述了国内外有关葛仙米化学成分及其主要生理活性的相关研究，为葛仙米的进一步合理开发利用提供重要指导和参考。

1 葛仙米主要化学成分

1.1 营养成分

葛仙米营养成分丰富，富含蛋白质和多糖类成分，氨基酸组成合理、配比均衡。刘金龙最早对湖北省鹤峰县的葛仙米干品进行了营养成分分析，发现葛仙米中蛋白质含量高达52%，总氨基酸含量为93.72 g/100 g蛋白质，其中6 种必需氨基酸占总氨基酸的42.3%，维生素C、维生素B1和维生素B2的含量分别为521、2.63、0.58 mg/100 g，并含有如铁、钙、钾等多种有益人体健康的微量元素[3]。夏建荣等通过分析却发现葛仙米中的蛋白质、氨基酸、总糖、粗脂肪和灰分的含量分别为28.38%、23.35%、24.19%、5.34%和14.63%[4]。汪兴平等比较分析了室内培养与野生葛仙米之间营养成分的差异，发现粗蛋白（分别为47.83%和48.61%）、粗脂肪（分别为7.28%和8.11%）、碳水化合物（分别为14.3%和12.69%）、维生素C（分别为 5.31 mg/g 和5.50 mg/g）和粗灰分（分别为9.56%和10.88%）等成分之间并无显著差别，都含有17 种氨基酸和人体7 种必需氨基酸，其中谷类蛋白质的第一和第二限制性氨基酸——赖氨酸和苏氨酸的含量较高，脂肪酸组成没有差异，都以中碳链为主，都富含多种维生素。与室内培养葛仙米相比，野生葛仙米中丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和谷氨酸含量下降，而甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸和半胱氨酸含量则上升，各种脂肪酸含量增加，B 族维生素含量低，维生素C、维生素E 和β-胡萝卜素含量稍高[5-6]。方倩等分析了葛仙米中11 种矿质元素的含量，发现钙的含量高达55 878.69 mg/kg，另外钾、镁和钠等含量也较高，而镉、铬等有害重金属含量都远低于国家规定的标准[7]。梅邢等探讨了微波炉、电磁炉和高压锅3 种不同加工方式对葛仙米营养成分的影响，发现经过加工处理后葛仙米中的总蛋白、脂肪、糖类和灰分等成分的含量都发生不同程度的降低，单糖组成也发生变化，甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸消失，产生了半乳糖醛酸。高压锅处理后葛仙米中氨基酸和必需氨基酸的保留率分别达到96.92%和97.31%[8]。

1.2 挥发性成分

程超等首先从未经熟制的葛仙米中检测到48 种挥发性物质，主要为 14 种烷烃类（42.151%）、10 种酸类（27.590%）和 11 种酯类（26.571%）物质，随后分析了微波炉、高压锅和电磁炉3 种不同烹调方式对其风味成分的影响，发现经微波炉、高压锅和电磁炉熟制后，葛仙米中分别仅含有16、16 和8 种挥发性物质；微波炉和高压锅熟制后，酯类物质的含量达到50%以上，而烷烃类物质的含量则下降到2.4%～3.1%；电磁炉熟制后则未检测到酯类物质，烷烃类物质也下降约一半。由于酯类物质大多具有酯的芳香气味，因此，经微波炉和高压锅熟制后的葛仙米更具有清香味[9]。

1.3 多糖

多糖是葛仙米中重要的活性物质之一，具有水溶性好、低浓度高黏度、稳定性优等特性[10-11]，因此，对葛仙米多糖的提取、鉴定以及特性分析引起了大家的关注。莫开菊等和邓伊苓等分别探讨和优化了葛仙米多糖的提取工艺，获得了一致的结果，水溶性多糖提取方法是：90 ℃，6 h，1 ∶90（mg/mL）加水，水提取 4 次，其中提取次数是对多糖提取影响较大的因素；碱溶性多糖提取方法是：1 mol/L 的 NaOH 溶液，6 h，1 ∶25（mg/mL）加碱，提取4 次，其中提取次数和碱液浓度是影响多糖提取较大的因素，所提取的水溶性多糖和碱溶性多糖都具有一般多糖的特征[12-13]。

莫开菊等采用热水浸提乙醇沉淀方法从葛仙米中提取纯化出多糖，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和HPLC-质谱联用法测定葛仙米多糖提取物的单糖组成，经分析发现所提取的葛仙米多糖中单糖组成摩尔比甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖 ∶半乳糖 ∶阿拉伯糖为 1 ∶1.12 ∶3.24 ∶1.72 ∶1.21[14]。苏攀峰等以室内人工培养的葛仙米为原料，采用热水浸提乙醇沉淀法提取其多糖，提取物中多糖含量为96.95%，平均分子量为1.324×102kDa，单糖组成和摩尔比阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖为 1 ∶6.73 ∶10.84 ∶5.27 ∶4.88 ∶3.92；多糖溶液的黏度随着质量浓度的增加而升高，随着剪切速率的增大而降低，具有剪切稀释的特性，是典型的假塑性非牛顿流体；在20 ℃～80 ℃范围内，多糖溶液的黏度随着温度的升高而降低；当溶液为中性（pH 7）时，多糖溶液的黏度达到最大；0.02 mol/L 的维生素C 和0.1 mol/L的H2O2都能降低多糖溶液的黏度；在0.1 Hz～10 Hz 的扫描频率内，储能模量（G'）和损耗模量（G″）将随着多糖溶液质量浓度的增加而增大，因此，增加多糖溶液的质量浓度能够增大其成胶趋势和弹性特性；葛仙米多糖与透明质酸具有协同增稠的作用，具有在化妆品方面应用的潜力[15]。LIU 等以葛仙米为材料，采用热水浸提40%乙醇沉淀提取纯化到水溶性葛仙米多糖，产量约为40.10%。葛仙米多糖提取物中可溶性糖的含量高达97.86%，平均分子量为 1.31×105g/mol，ρ 值为1.50，说明其水溶液中存在柔性的无规则卷曲构象，多糖提取物中单糖成分的摩尔比甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶半乳糖 ∶葡萄糖醛酸为 1.00 ∶1.92 ∶0.97 ∶1.02 ∶0.91[16]。LI 等以人工培养的葛仙米为材料，依次经过风干、研磨、乙醇回流、离心收集沉淀、水浸泡过夜、热水提取、木瓜蛋白酶消化、乙醇沉淀、复溶、透析、冷冻干燥等过程制备成葛仙米多糖提取物，其可溶性多糖含量约80%，分子量平均值为1.99×103kDa。该多糖提取物中含有34.5%甘露糖、21.8%果糖、14.6%半乳糖、17.7%葡萄糖、6.1%木糖、2.2%鼠李糖和3.1%半乳糖醛酸。该多糖提取物具有多糖典型的红外吸收光谱特征和表面粗糙的非晶形态，具备较强的吸湿保水能力和较高的相对黏度[17]。朱玉婷等研究了葛仙米多糖的硫酸酯化修饰工艺，发现采用氯磺酸-吡啶法进行葛仙米多糖硫酸酯化修饰的最佳条件是：V氯磺酸∶V吡啶比例为1 ∶4，反应温度是 70 ℃、反应时间为 6 h，在此条件下获得的产物取代度达到1.042，具有硫酸酯键的特征吸收峰[18]。

1.4 藻胆蛋白

葛仙米中藻胆蛋白（phycobiliprotein，PBP）含量丰富，主要包括藻红蛋白（phycoerythrin，PE）和藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）等。最早汪兴平等先用反复冻融法破除葛仙米的细胞壁，即将葛仙米粉在0 ℃条件下放置0.5 h 后再进行研磨，重复3 次后提取，进一步采用正交旋转组合实验对藻胆蛋白提取工艺进行优化，确定了葛仙米藻胆蛋白的最佳提取条件是：在含0.21 mol/L NaCl 的pH 7.3 的磷酸盐缓冲液中浸提4.3 h，在该条件下藻胆蛋白的得率为7.125%[19-21]；进一步采用层析、电泳、质谱等技术从中分离纯化鉴定出葛仙米藻蓝蛋白和藻红蛋白，发现藻蓝蛋白和藻红蛋白都主要以α-螺旋结构为主，藻胆蛋白在40 ℃以下，酒精浓度40%以下，pH 值在5～8 的范围内比较稳定[21-23]。余佳等获得的超声辅助提取葛仙米藻胆蛋白的工艺是：超声功率700 W、葛仙米粒径数120 目～200目、液料比 58 ∶1（mL/g）、提取温度为 42 ℃、提取时间为6 h，此时葛仙米藻胆蛋白的提取率为26.13%，进一步利用一步离子交换层析获得了纯度分别达83.5%的藻红蛋白和93%的藻蓝蛋白[24]。田盼盼等利用逐级盐析法结合双水相萃取从葛仙米中提取、纯化并鉴定出藻蓝蛋白，建立了藻蓝蛋白提取工艺：先用20%的（NH4）2SO4进行盐析，离心去沉淀，上清液然后用40%和50%的（NH4）2SO4盐析获得藻蓝蛋白，最后用10%的聚乙二醇 6000 和18%的（NH4）2SO4进行双水相萃取，所得藻蓝蛋白产物纯度达到8.6，回收率为71.40%[25]。

1.5 脂肪

葛仙米中脂肪含量比较少，相关研究报道也不多。PARK 等以新鲜葛仙米为材料，经过冷冻干燥、研磨、氯仿/甲醇振荡提取获得葛仙米脂质提取物，该提取物中包含有色素、游离脂肪酸、甘油三酯、维生素E和蜡酯等成分，其中游离脂肪酸的含量约为15%，游离脂肪酸中包含有26%棕榈酸、24%棕榈油酸、16%亚油酸和25%亚麻酸，色素主要为β-胡萝卜素，含量为 70 mg/100 g 干重[26]。

1.6 其它物质

在自然环境中，葛仙米在干燥和再水合状态之间周期性重复，在干燥阶段，葛仙米经受如干燥、热、紫外线和氧化等各种胁迫，因此，葛仙米自身也发展出不同的机制来耐受这些胁迫环境。葛仙米耐受紫外线的机制之一是能够产生类菌胞素氨基酸（mycosporinelike amino acid，MAA）物质，研究人员从葛仙米中分离纯化并鉴定出一个具有防紫外线功能的新型糖基化MAA——13-O-β-半乳糖基-卟啉-334（13-O-βgalactosyl-porphyra-334，β-Gal-P334），β-Gal-P334 在334 nm 处有最大吸收值[27]。

2 葛仙米主要生理活性

2.1 抗氧化活性

葛仙米中存在多种具有抗氧化活性的成分，如藻胆蛋白和多糖等。汪兴平等在对葛仙米藻红蛋白进行提取、分离与纯化基础之上，发现葛仙米藻红蛋白在体外具有清除氧自由基的能力[28]；随后发现藻蓝蛋白能够有效减少肝脏和血液中丙二醛及过氧化物的含量，并发现反复冻融的破壁处理方法和磷酸缓冲液作为提取液都能明显增强藻胆蛋白的抗氧化能力[29-31]。TANG 等以葛仙米为材料，采用水溶醇沉的方法提取多糖（可溶性糖含量为46.2%），该多糖提取物对超氧阴离子、羟自由基具有有效的清除能力，对脂质过氧化具有抑制作用，并对人胚肾细胞293 中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性具有促进作用[32]；LI 等以百草枯引起的氧化胁迫线虫为模型，发现葛仙米多糖提取物能够抑制线虫在胁迫条件下活性氧的产生，减少蛋白质羰基化和脂质过氧化，激活超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，从而提高线虫在氧化胁迫下的存活率[17]，因此，葛仙米多糖是食品和制药工业中天然抗氧化剂的潜在来源。ISHIHARA 等以人角质细胞系HaCaT 为材料，发现葛仙米中的MAA 物质β-Gal-P334 在长波紫外线（ultraviolet radiation a，UVA）和中波紫外线（ultraviolet radiation b，UVB）诱导的细胞损伤中都具有保护作用，采用比色法和电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）法证明β-Gal-P334 还具有抗氧化活性，因此，β-Gal-P334 可以作为化妆品和盥洗用品的潜在原料进行开发利用[27]。

2.2 抗菌消炎活性

常向东等首先从葛仙米中提取水溶性多糖，然后采用滤纸贴片法分析了水溶性多糖的抑菌活性，结果表明葛仙米水溶性多糖对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑曲霉菌都有抑制作用，其中对绿脓杆菌的抑制能力最强，说明葛仙米可以作为新型抗菌药物和植物防腐剂进行开发[33]。PARK 等以RAW 264.7巨噬细胞为模型，发现葛仙米脂质提取物能够抑制促炎介质如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、环氧合酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2）、白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达，减少 TNF-α 和 IL-1β 的分泌，降低核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的DNA 结合能力；脂质提取物中的游离脂肪酸也能抑制TNF-α、COX-2 的表达，但效果没有脂质提取物显著，说明葛仙米脂质提取物中还含有除游离脂肪酸以外的具有抗炎特性的其他生物活性化合物[26]。随后，KU 等采用葛仙米脂质提取物对RAW 264.7 巨噬细胞进行预处理，发现其对脂多糖诱导的TNFα、IL-1β 和IL-6 的表达具有抑制作用，引起TNFα、IL-6、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，GCSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF） 以及单核细胞趋化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）分泌的减少；从饮食中添加葛仙米脂质提取物喂养的载脂蛋白E 敲除（ApoE-/-）小鼠中分离出脾细胞，发现其中的IL-6 的表达水平也明显降低，说明葛仙米脂质提取物对促炎细胞因子的表达和分泌均具有抑制作用[34]。这些研究结果为抗炎药物的研发提供重要依据。

2.3 增强免疫活性

Yang 等先后以 HepG2 细胞和 4 周龄 C57BL/6J 小鼠为材料，对葛仙米的己烷、氯仿、甲醇和水提物进行体外和体内的安全性评价，结果表明：添加葛仙米提取物的细胞培养物中不含有微藻毒素，并且对细胞的毒性非常小；在小鼠饮食中长时间添加葛仙米提取物也没有引起明显的副作用。说明葛仙米可开发为对健康有益的安全天然食品[35]。程超等探讨了葛仙米藻胆蛋白对昆明小鼠免疫功能的影响，发现葛仙米藻胆蛋白可以提高小鼠中腹腔巨噬细胞吞噬率、自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性、T 淋巴系统增殖以及血清中白细胞介素（interleukin-2，IL-2）和 IL-4 细胞因子的表达水平，还能提高小鼠的迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）[36]；LIU 等发现葛仙米多糖提取物能够刺激RAW264.7 巨噬细胞中NO 的释放[16]。这些结果表明葛仙米藻胆蛋白和多糖都具有强大的免疫增强生物活性，可以作为一种潜在的免疫增强剂进行开发利用。

2.4 抑制肿瘤活性

莫开菊等通过建立S180昆明雌性肿瘤小鼠模型，分析了葛仙米多糖在体内的抑瘤效果和对免疫能力的影响，发现葛仙米多糖能够显著抑制小鼠肿瘤的生长，且抑瘤效率呈剂量效应；对肿瘤所致的小鼠细胞免疫力如脾淋巴细胞转化、NK 细胞活性、DTH 下降等都有显著的抑制作用，对重要免疫器官胸腺具有一定的抑制作用，但是对肾脏指数、肝脏指数以及血液和肝脏中的氧化指标没有明显影响[37]。汤俊等以人肝癌HepG2 细胞株为模型，探讨了葛仙米甲醇提取物的抗肿瘤活性，结果表明，葛仙米甲醇提取物能够有效抑制人肝癌HepG2 细胞的生长，通过采用形态学、Annexin V/PI 双染以及碘化丙啶单染流式细胞术法检测，证明葛仙米甲醇提取物能够显著诱导肝癌细胞HepG2 的凋亡[38]。LI 等发现葛仙米多糖提取物能够抑制 A549、HepG2、PC3、MCF-7 和 Jurkat 等多种肿瘤细胞的增殖，在人肺癌A549 细胞中，还能通过激活caspase-3 途径诱导细胞凋亡[17]。

2.5 调节胆固醇代谢活性

为了探讨葛仙米对胆固醇代谢的作用，RASMUSSEN 等以HepG2 细胞为材料，通过添加不同浓度的葛仙米脂质提取物，发现葛仙米脂质提取物能够显著降低细胞中3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR） 和低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）在mRNA 和蛋白质水平上的表达，从而抑制胆固醇的合成；为了进一步分析葛仙米脂质提取物抑制HMGR 和LDLR 表达的分子机制，发现葛仙米脂质提取物能够抑制甾醇调节因子结合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）-1 和 SREBP-2 的成熟加工过程，降低SREBP-1 应答基因如脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS） 和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1（stearoyl CoA desaturase 1，SCD-1）的表达[39]。随后，又以C57BL/6J 雄性小鼠为模型，分别通过短时间和长时间在饮食中添加葛仙米粉末进行饲养，发现葛仙米粉末能够显著降低血浆中总胆固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）的含量，抑制肠道对胆固醇的吸收，有助于甾醇从粪便中排泄出来；促进肝脏中 SREBP-2、HMGR、LDLR、SCD-1、乙酰辅酶 A 羧化酶 1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC-1）、肉毒碱棕榈酰转移酶 1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT-1α）和乙酰辅酶 A 氧化酶 1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX-1）在mRNA 水平上的表达以及FAS 在蛋白质水平的积累[40-41]。KU 等以动脉粥样硬化小鼠模型——载脂蛋白E 敲除（ApoE-/-）小鼠为材料，在饮食中连续12 周添加5%的葛仙米粉末，结果发现，通过在饮食中添加葛仙米粉末，小鼠血浆中TC 和TG 的含量都显著降低，肝脏中TC 含量和脂质积累也明显减少，FAS 的表达水平也降低，从而使主动脉病变发展程度降低[42]。因此，补充葛仙米可以通过减少肠道胆固醇吸收和促进甾醇排泄，降低动脉粥样硬化病变的发生，说明其具有作为一种动脉粥样硬化天然保护剂来进行开发利用的前景。

2.6 抗凝血活性

虽然葛仙米多糖本身没有抗凝血活性，朱玉婷等通过分析不同取代度和不同浓度葛仙米多糖硫酸酯的抗凝血活性，发现葛仙米多糖的硫酸酯化产物具有抗凝血活性，随着多糖中硫酸酯取代度的增大，活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplasting time，APTT）和凝血酶时间（thrombin time，TT）也随之延长，并具有量效关系，但对凝血酶原时间（prothrombin time，PT）的作用不显著，推测葛仙米多糖硫酸酯主要是通过抑制内源性凝血过程和共同凝血途径从而发挥抗凝血作用，对外源凝血途径的影响较小[43]。

3 展望

葛仙米营养价值丰富，食用药用历史悠久，具有多种生理活性，并已被国家列入新食品原料，因此，葛仙米具有非常广阔的开发应用前景。目前，葛仙米的研究工作主要集中在藻胆蛋白和多糖等少数成分的分离提取与活性鉴定上，限制了葛仙米的开发与应用范围。今后葛仙米的研究工作将主要集中在以下几个方面：（1）优质葛仙米品种的选育及种质资源库的建立。现有的葛仙米种质退化严重，性状不佳，迫切需要选育一批抗逆性强、营养价值高且生长速度快的优良新品种或新品系；（2）进一步加强葛仙米活性成分的挖掘与作用机制研究，包括糖类物质的进一步分离纯化与鉴定、MAA 等类似功能成分的鉴定、活性成分对生理功能的具体调节机制与调节网络等，从而为葛仙米在功能性食品和药品上的深度开发应用提供充分依据；（3）进一步拓宽葛仙米的应用价值，目前葛仙米主要是用于食品及其初加工产品，开发利用程度不高、附加值低、效益不显著，最近研究人员将葛仙米用于个性化的3D 食品打印中[45]，拓宽了葛仙米的应用领域，也为今后提高葛仙米的合理开发利用程度提供借鉴。