不同浓度二甲双胍对大鼠脂肪代谢相关基因Galectin-3、PPARγ mRNA及蛋白表达的影响Δ

兰 天，刘巍梦，邹 阳，邱 平

(1.成都医学院第一附属医院内分泌代谢科， 四川 成都 610500； 2.攀枝花市第六人民医院妇科， 四川 攀枝花 617023； 3.重庆市第九人民医院内科， 重庆 400700)

脂肪组织主要由脂肪细胞组成，又分为白色脂肪和棕色脂肪[1]。棕色脂肪以保温为主；白色脂肪是体内脂质吸收、合成和储存的主要形式，当机体出现能量缺乏时，白色脂肪发生脂肪动员分解为甘油和脂肪酸为机体供能，因此，脂肪代谢在机体能量代谢中具有一定作用[2-3]。脂肪代谢分为合成和分解2种代谢模式，合成代谢主要是游离的脂肪酸、甘油等转化为三酰甘油进行储存；分解代谢是将脂肪分解供组织器官供能的过程。2种代谢在机体中共同作用，但由于2种代谢过程复杂，容易受到细胞因子、炎症因子等因素的影响[4-6]。Galectin-3属于半乳糖凝集素家族成员，在以往研究中发现其对脂肪代谢调控具有重要作用，可促进脂肪的合成代谢[7]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)作为一种核受体转录因子，在脂肪组织中的含量较多，PPARγ被激活后，前脂肪细胞转化为成熟脂肪细胞，显著增加小脂肪细胞数目，增加胰岛素敏感性，更有利于脂肪分解，对脂肪的分解代谢具有一定临床意义[8-9]。二甲双胍是治疗糖尿病的常用药，可降低空腹血糖和餐后血糖，同时增加血糖耐受性，对组织代谢具有调控作用。相关研究结果发现，二甲双胍对肥胖糖尿病患者有减轻体质量的作用，但二甲双胍对脂质代谢的影响机制尚不明确[10]。因此，本研究探讨了不同浓度二甲双胍对SD大鼠脂肪代谢相关基因Galectin-3、PPARY mRNA及蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物

选取医院动物中心成年SD雄性大鼠30只，体质量170～200 g；实验前2周开始适应性喂养，温度20～25 ℃，湿度50%～70%。

1.2 药品与试剂

盐酸二甲双胍缓释片(生产厂家为辽宁奥达制药有限公司，批准文号为国药准字H20070117，规格为0.5 g)；β-actin多克隆抗体、Galectin-3多克隆抗体及PPARγ单克隆抗体购自北京义翘神州科技有限公司；发光液、显影液及定影液购自衡水医疗器械有限公司；TRNzol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇及缓冲液等购自江西派尼生物药业有限公司。

2 方法

2.1 分组与给药

参照人与大鼠体表面积的剂量比值表及70 kg体质量人体服用二甲双胍正常剂量(500 mg)和最大剂量(2 000 mg)进行换算，可得大鼠正常剂量(45 mg/kg)和最大剂量(180 mg/kg)。将30只SD大鼠按照随机数字表法分为A、B及C组，每组10只，分别按照二甲双胍0、45及180 mg/kg进行处理72 h后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，在无菌环境下取出脂肪，以锡箔纸包裹后置于超低温(-80 ℃)冰箱中保存待测。

2.2 检测指标的测定

(1)总RNA提取：取出脂肪组织研磨至粉末状，按照50 mg组织∶1 ml TRNzol比例混合后在12 000 r/min离心机中离心15 min，取上清液；按照每1 ml TRNzol添加200 μl氯仿的比例混匀，室温(25 ℃)下静置3 min后，同转速再次离心15 min，取上层无色水相部分，同时加入等体积异丙醇混匀，室温下静置20 min；同转速再次离心10 min,倒出上清液保留沉淀，采用1∶1.5的75%无水乙醇进行洗涤，以5 000 r/min转速离心3 min保留沉淀，根据沉淀量加入30～100 μl的RNase-free ddH2O溶解后置于超低温冰箱中保存。(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物设计：采用GenBank搜索大鼠Galectin-3、PPARγ、C反应蛋白(CRP)及白细胞介素1β(IL-1β)基因全序列，确定合适序列后通过北京博奥森生物技术有限公司合成引物，见表1。(3)采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)联合Image J软件测定Galectin-3、PPARγ、CRP、IL-1β的mRNA表达水平；采用western blot检测Galectin-3、PPARγ的蛋白表达。RT-PCR和western blot具体方案按照说明书进行。

表1 PCR反应特异性引物Tab 1 Specific primers of PCR Reaction

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度二甲双胍对Galectin-3、PPARγ的mRNA相对表达的影响

不同浓度二甲双胍处理后，C组大鼠Galectin-3 mRNA相对表达明显低于A、B组，且B组大鼠明显低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组大鼠PPARγ mRNA相对表达明显高于A、B组，差异有统计学意义(P<0.05)；而A、B组大鼠PPARγ mRNA相对表达的差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、表2。

图1 三组大鼠Galectin-3、PPARγ的mRNA表达比较Fig 1 Comparison of mRNA expression of Galectin-3 and PPARγ among three groups

组别mRNA相对表达Galectin-3PPARγA组(n=10)1.31±0.120.72±0.12B组(n=10)1.13±0.11∗0.81±0.13C组(n=10)1.02±0.10∗#0.94±0.12∗#F23.3338.030P<0.0010.002

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

Note:vs. group A,*P<0.05; vs. group B,#P<0.05

3.2 不同浓度二甲双胍对CRP、IL-1β基因mRNA相对表达的影响

不同浓度二甲双胍处理后，C组大鼠CRP、IL-1β mRNA相对表达明显低于A、B组，且B组大鼠明显低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、表3。

图2 三组大鼠CRP、IL-1β的mRNA表达比较Fig 2 Comparison of mRNA expression of CRP andIL-1β among three groups

组别mRNA相对表达CRPIL-1βA组(n=10)0.91±0.111.15±0.10B组(n=10)0.53±0.10∗0.72±0.11∗C组(n=10)0.42±0.09 ∗#0.24±0.08∗#F65.662218.140P<0.001<0.001

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

Note: vs. group A,*P<0.05; vs. group B,#P<0.05

3.3 不同浓度二甲双胍对Galectin-3、PPARγ蛋白表达的影响

不同浓度二甲双胍处理后，C组大鼠Galectin-3蛋白相对表达明显低于A、B组，且B组大鼠明显低于A组；C组大鼠PPARγ蛋白相对表达明显高于A、B组， B组大鼠明显高于A组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3、表4。

4 讨论

二甲双胍是常用的双胍类衍生物，是糖尿病的常用治疗药物，可显著降低患者血糖水平，同时具有改善胰岛素抵抗的功能[11]。二甲双胍治疗糖尿病已有几十年的历史，其不仅能够控制肥胖糖尿病患者的血糖水平，同时可明显降低体质量[12]。二甲双胍与脂肪代谢之间的关系受到医学工作者的重视。

图3 三组大鼠Galectin-3、PPARγ的蛋白表达比较Fig 3 Comparison of protein expression of Galectin-3 and PPARγ among three groups

组别蛋白表达Galectin-3PPARγA组(n=10)1.73±0.160.31±0.08B组(n=10)1.04±0.13∗0.49±0.11∗C组(n=10)0.41±0.10∗#0.54±0.10∗#F249.08515.403P<0.001<0.001

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

Note: vs. group A,*P<0.05; vs. group B,#P<0.05

脂肪代谢相关基因Galectin-3、PPARγ对体内脂肪代谢具有良好的代表作用。以往研究结果发现，外源性Galectin-3对成纤维细胞增殖有刺激作用，同时可促进脂肪的合成代谢[13-14]。Baek等[15]的动物实验研究中，敲除Galectin-3基因的小鼠在相同条件下高脂水平喂养，体质量、白色脂肪组织显著低于未敲除Galectin-3基金的小鼠，说明Galectin-3具有促进脂肪合成的作用。人体大多数组织均可分泌PPARγ，其在脂肪细胞中可促进脂肪乳化，使脂肪细胞转化为多个小脂肪细胞，进而促进脂肪分解。Greenstein等[16]的研究结果显示，肝脏、脂肪等部位对活性PPARγ较为敏感，当出现PPARγ活性降低时，脂肪分解能力下降，同时小脂肪细胞减少，一定程度上增加了胰岛素抵抗，故PPARγ被认为是脂肪细胞分化的主要调控因素。本研究结果显示，采用二甲双胍处理后，SD大鼠的Galectin-3 mRNA及其蛋白的表达水平降低，PPARγ mRNA及其蛋白的表达水平升高，同时，二甲双胍浓度越高，上述变化程度越明显，体现了一定的剂量依赖关系，表明二甲双胍对脂肪代谢有一定的调控作用，可能与影响Galectin-3、PPARγ mRNA和蛋白表达有关。而炎性因子对脂肪分化有一定的影响，IL-1β多由脂肪细胞和巨噬细胞产生，可通过激活促炎细胞信号分子来阻断脂肪分化[17]。CRP在机体组织出现损伤、坏死等情况下会出现表达升高，可直观反应炎症程度。有研究结果发现，PPARγ在参与脂肪代谢中与炎性相关因子表达有关[18]。有研究结果认为，肥胖不仅是脂肪堆积导致的单一性疾病，还是一种慢性炎症性疾病，在肥胖患者中IL-1β、CRP等炎性因子表达升高，并与肥胖程度的进展和并发症有关，因此，理论上可通过降低炎性因子水平来控制肥胖[19-20]。本研究结果显示，二甲双胍处理后，大鼠炎性因子IL-1β、CRP mRNA表达水平明显降低，同时呈一定的浓度依赖性。

综上所述，二甲双胍可抑制脂肪代谢基因Galectin-3的mRNA及蛋白的表达，促进成脂基因PPARγ的mRNA及蛋白的表达，增加CRP、IL-1β的mRNA表达水平，共同调节脂肪代谢。