中性粒细胞胞外诱捕网检测技术的研究进展

陈玉年，顾兵，李华南

中性粒细胞是人体血液中的主要白细胞群，在非特异性免疫机制中起重要作用。2004 年，Brinkmann等［1］首次证明，中性粒细胞可通过形成一种带有强大负电荷的网状结构捕获病原体，并将该网状结构命名为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）。中性粒细胞受多种病原微生物、脂多糖、豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol myristate acetate，PMA）、活化的血小板及一些炎性介质刺激后，发生染色质解聚，核膜崩解。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、α 防御素和抗菌肽等颗粒蛋白黏附于解聚染色体，并释放到胞外形成NETs。其形成通常伴随着中性粒细胞破坏和病原体的死亡，这一过程称之为网捕死亡（NETosis）［2］。NETs 概念的提出打开了中性粒细胞在免疫学研究中的新纪元，当前有关NETs 的关注焦点在于NETs与疾病的相关性和网状结构形成的治疗潜力。

NETs与多种疾病的发病和治疗存在密切关联，表现为“双刃剑”作用。一方面它既能在感染性疾病中防止病原微生物的扩散和起杀灭作用，如金黄色葡萄球菌［3］、肺炎链球菌［4］、结核分枝杆菌［5］和呼吸道合胞体病毒［6］等；另一方面NETs是引起部分免疫性疾病的发病因素，如小血管炎［7］、系统性红斑狼疮［8］等自身免疫缺陷性疾病。此外，在急性痛风性炎症反应中，聚集性NETs可通过丝氨酸蛋白酶诱捕和降解白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α等促炎细胞因子缓解炎症反应［9］。目前对NETs在机体不同生理及病理状态下的形成及作用认识仍较局限，但已经相继开展了关于NETs在微生物感染的治疗、自身免疫性疾病的防治等方面的研究，这将可能为感染、自身免疫性疾病及血栓性疾病提供潜在治疗方向。因此，熟悉检测NETs的方法并合理运用有利于保证NETs检测的准确性，从而有助于对疾病的诊断以及探索一些新的治疗靶点。鉴于目前尚未建立完整的标准化评价系统，本文拟对国内外已经报道的各种NETs检测方法进行分类，评价其优缺点，为临床应用提供参考。

1 形态学观察

电镜扫描正常中性粒细胞显示细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连，胞浆内含多种小颗粒物质。Brinkmann 等［1］利用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察到中性粒细胞在PMA 或脂多糖的刺激作用下形态发生变化。SEM图像显示，中性粒细胞被激活后，细胞扁平化，细胞核分叶结构消失，核膜溶解，核内物质释放到胞质中，随后质膜崩解，细胞内容物释放到胞外形成纤维状结构，其TEM 图像证实了NETs 无质膜结构包裹。单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体是诱发痛风性关节炎的主要诱因。Schauer 等［10］采用视频时差显微镜记录了MSU 晶体体外诱导NETs 的形成过程，中性粒细胞的胞核失去原有结构，在此分解过程中，染色质外化，形成与微生物诱导产生类似的网状结构，证实了痛风性关节炎中存在NETs。Borenstein等［11］利用TEM观察了细菌刺激口腔中性粒细胞的形态学特征，深化了对口腔健康和中性粒细胞活化状态差异性的理解。利用显微技术进行形态学观察方便、快捷，但判断过程存在主观性，且NETs 网状结构脆弱，增加了标本制作和保存的难度。此外，嗜酸性粒细胞、肥大细胞等免疫细胞受刺激后也会产生胞外诱捕网［12］。因此，形态学观察只适合对NETs进行初步判断，作简单定性。

2 游离DNA/NETs组分检测

在NETs 发现之前，游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的检测早已在临床上应用于诊断濒危细胞或组织。cfDNA作为一种危险相关分子模式可以激活机体自身免疫应答反应，故cfDNA/NETs常用作评价机体感染程度的指标［13］。此外，随着对cfDNA 构成NETs基本骨架的认识，检测网状结构形成过程中释放的cfDNA可用于有效评价NETs。

2.1 电泳技术 按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术包括琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳2种方法，其能够用于分离、鉴定和纯化DNA 片段。cfDNA 是高度碎裂的双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）片段，利用电泳虽不能排除其他方式产生dsDNA 的干扰，但血清中其他方式产生的dsDNA量所占比例较网状结构形成过程中产生的量低，因此依然可有效鉴定核酸情况。国内有研究人员以PMA 诱导外周血中性粒细胞形成NETs，对样品分别给予RNA 酶、DNA 酶处理、两者兼有以及不处理，随后进行琼脂糖凝胶电泳验证核酸的形成，结果显示网状结构中的核酸为dsDNA；进一步采用荧光染色法测定DNA 含量，发现NETs 中的DNA 常以DNA-蛋白质复合物存在［14］。Yu等［15］采用非变性聚丙烯凝胶电泳分析尿路感染中样本的活性蛋白质-DNA 复合物，分别用考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质，溴化乙锭测定DNA，比较两者显色区域，结果证实在NETs 中富集DNA-蛋白质复合物，随后用质谱技术验证了这一观点。电泳技术鉴定cfDNA 简单、快速，能够有效分解DNA 片段，其缺陷是不能确认cfDNA 是否完全来自于NETs，无法排除如组织损伤、细胞凋亡和坏死导致的其他cfDNA 的干扰，因此，电泳技术常在实验室中用于定性分析NETs。

2.2 荧光染色法 利用特殊荧光染料与双链DNA特异性结合，荧光分析仪在特定波长处检测荧光强度，可定量分析cfDNA/NETs。传统聚合酶链反应（PCR）技术通过凝胶电泳检测扩增后的终点产物进行定量分析，其时间消耗和多个人为操作步骤导致该过程存在易污染、重复性差等缺点，这可能限制了NETs的检测准确性，荧光PCR技术利用荧光信号采集系统实时监测整个量化进程，简化操作流程，克服了传统PCR 的缺点。随着荧光显微镜的普及，免疫荧光标记的方法也日益应用广泛，尤其是荧光双标或多标法。在急性痛风性炎症反应中，Mitroulis等［16］采用DNA 和MPO 双重染色对痛风性关节炎模型滑液内的中性粒细胞进行共定位分析，在免疫荧光显微镜下观察到了网状结构（首次在痛风性关节炎中证实NETs），并提出白细胞介素-1β 参与了NETs 的形成。随着急性痛风性关节炎炎症反应自发消退机制的提出，Schauer 等［10］利用DNA 和NE 双重染色免疫荧光图像分析证实：在慢性痛风性关节炎中，NETs可通过降解趋化因子和细胞因子缓解炎症反应。为克服单通道免疫荧光显微分析存在的主观性，Brinkmann等［17］采用双通道荧光染色和自动图像分割的方法来确定染色质解聚。该方法简化了操作步骤，且利用染色强度对cfDNA进行量化，适用于简单的显微设备和借助微量滴定板的高通量筛选技术，但病原体DNA 会干扰荧光信号分割，导致偏差较大。Vong 等［18］在双通道荧光染色基础上利用DNA、NE和瓜氨酸化组蛋白（H3Cit）的叠加显色，建立了三通道荧光免疫染色，该方法可用作量化和可视化NETs 的补充方法，但分析过程复杂，标记缺乏灵活性。此外，免疫荧光技术普遍存在荧光淬灭现象，因此样品不能长期保存。由于抗体不纯或交叉反应等原因，还可产生非特异性荧光干扰。Rebernick等［19］在免疫荧光分析法的基础上，以类风湿性关节炎患者滑液中的NETs为研究对象，建立了DNA 面积与NETosis 分析法。它是一种基于Image J/Java程序的半自动量化网状结构和DNA区域的方法，可解决分割多个细胞和消除细胞碎片所产生的限制问题，避免样品间的偏差，降低个体差异。该法还具有易用性和灵活性等优点，可根据实验室条件和细胞类型进行优化。

2.3 共聚焦显微技术 在荧光显微镜成像的基础上，共聚焦显微技术以激光作为光源，紫外光或可见光激发荧光探针，再利用计算机进行图像处理。采用共聚焦显微镜可在细胞、组织切片以及亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，它还可进行单色/多色荧光、z 轴采集、三维重构、时间序列成像和荧光强度测量等多种检测［20］。研究表明NETs 中含有大量的内源性抗生素：阳离子抗菌肽LL-37，基于LL-37 的阳离子特性，可与网状结构的DNA 结合，从而保护DNA不被核酸酶降解［21］。在利用荧光染料作为DNA 结合物检测NETs 的分析方案中，染料与dsDNA 通过插层、静电作用等方式结合而使荧光显著增加，LL-37 与DNA 的结合，减弱了DNA 小片段（当dsDNA 用核酸酶处理时）与荧光染料的相互作用，导致荧光强度降低，从而阻碍荧光染色的可视化［22］。因此，以酶及其抗体为基础的免疫荧光共定位技术是NETs可视化和定量分析的第一选择［23］。石蜡切片能较好地保存组织结构，是常用的免疫组织化学常规制备切片方法之一。Brinkmann 等［24］采用石蜡包埋后的组织切片，使用未标记的初级抗体及特异性次级抗体的结合抗体，与宿主血清蛋白交叉吸收，避免了由于交叉标记而产生的假阳性染色。此外，该研究还比较了不同抗原提取方法和对不同抗体的检测效果，结果显示组蛋白H2B 抗体和H3Cit抗体在55°C孵育时均与致密或解聚染色体发生强烈结合，且染色效果最佳。Santos 等［25］在MPO与H3Cit 共定位的基础上，采用共聚焦显微镜鉴定血栓样本中的NETs 结构，证实了MPO 在NETs 形成过程中与NE 协同促进染色质解聚。这两种蛋白质的共定位能较好地将NETosis 与其他细胞死亡形式区分开来，在NETs的鉴定中得到了广泛应用。为进一步探究NETs 的信号调节通路，Desai 等［26］以MSU晶体诱导小鼠气囊炎模型，进行NE、H3Cit 和DNA共染色，证实了受体相互作用蛋白激酶1/3和混合谱系激酶结构域样蛋白参与MSU 晶体诱导的NETs 形成，且是信号通路中的重要分子靶点。随后，Ginley等［27］设计了一种结合流式细胞术和细胞成像的方法，其基于使用共定位标记NETs 组分，通过设定阈值依次消除不符合条件的像素。这一方法可重复性较好，敏感度和特异度较高，但在不同疾病环境条件下对量化NETs的效果有待进一步证明。

共聚焦免疫荧光显微镜技术是一种重复性好，能对不同实验室样本结果进行比较，可直接研究NETs 固定样品结构的有效方法。但免疫荧光共定位对图像扫描参数有着严格的要求，且样本制作要进行多重染色，步骤繁多，成本昂贵。

3 蛋白质组分检测

MPO 和NE 等颗粒蛋白是组蛋白参与染色质去致密化过程最重要的蛋白酶，存在于中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。此外，组蛋白翻译后的修饰，如乙酰化、磷酸化和甲基化，可调节各种染色质功能，如染色质缩合/解聚，故H3Cit 作为网状结构的生物标志物常用作NETs 的检测指标［28］。因此，分析NETs中的典型蛋白质类组分可有效检测NETs 的形成和相关的生理变化。

3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA） 通过底物的颜色变化判定相关免疫反应的发生，颜色的深浅与标本中相应抗体或抗原含量呈正比，ELISA 以此达到定量分析。肽酰基精氨酸脱亚氨酶（peptidylarginine deaminase，PAD）4 在粒细胞中高度表达，通过介导H3Cit 参与NETs 形成。Thålin 等［29］用脂多糖诱导缺血性脑卒中患者血浆样品，以PAD4-H3Cit 为对照组，通过ELISA 法定量分析H3Cit 和游离瓜氨酸在450 nm 波长处的光密度值，其结果显示游离瓜氨酸剂量对光密度值影响较低，两者呈线性关系，排除了血浆中游离瓜氨酸对检测结果的影响，由此建立了一种快速、可靠地检测血浆中H3Cit 的方法。该研究还发现痛风石中通常存在多种蛋白质组分，如白细胞介素-1β、抗炎蛋白和促炎蛋白以及MPO 等酶类等。Sil 等［30］采用ELISA 法检测痛风性关节炎中MPO 和NE 的表达情况，提出巨噬细胞受MSU 晶体刺激后通过分泌白细胞介素-1β促进NETs形成，随后，激光共聚焦显微镜观察结果证实了这一结论。研究人员在此基础上设计了活细胞成像的荧光标记试验，呈现了中性粒细胞释放DNA 的动态过程，同时记录了DNA 的结构变化［31］。ELISA 作为一种特异性检测NETs 的方法，快捷方便，不需要特殊仪器设备，但受环境因素影响多，且仍存在非特异性免疫荧光的影响。

3.2 蛋白质印迹法 蛋白质印迹法又称免疫印迹试验，结合凝胶电泳和免疫性标记技术，通过分析特异性抗体对凝胶电泳处理过的样品着色位置和深度，获得特定蛋白质在样品中的表达情况。Chatfield 等［32］利用此法对比MSU 晶体和PMA 诱导形成的NETs中蛋白质组分表达情况，结果显示MSU晶体诱导产生的NETs中富含肌动蛋白，提出两者通过不同途径形成NETs，这一说法在临床得以证实，患者痛风石中检测到了富含肌动蛋白的晶体。NETs可能限制了痛风患者持续性炎症反应的发展，这也符合临床症状中炎症自发消散现象［33］。炎症小体作为激活痛风性炎症发作的开关，其活化机制与细胞自噬有关［34］。在MSU 晶体刺激中性粒细胞一定时间后，采用蛋白质印迹法结合共聚焦显微技术分析细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的变化情况，证实痛风中NETs的激活与白细胞介素-1β和细胞自噬信号通路有关［16］。PAD4 可加重炎症性关节炎，是NETs形成的关键，PAD2对健康组织中的瓜氨酸化至关重要，但其在炎症性关节炎和网状结构中的作用尚不清楚。Bawadekar 等［35］分析小鼠类风湿性关节炎模型中的PAD2、PAD4 和免疫球蛋白G的表达水平，结果显示PAD2 对肿瘤坏死因子-α 诱导的瓜氨酸化和关节炎炎症有促进作用，但不是NETs 形成所必需。NETs 中含有高浓度、多种类的蛋白质组分，免疫印迹法可从分析蛋白组分方面解决网状结构中的定性和定量问题，其应用范围广。但因样品制备过程中易存在人为失误，使定量分析结果偏差大，故常用作定性分析。

3.3 流式细胞术 基于DNA的荧光标记示踪NETs敏感度低，而流式细胞术可通过检测悬液中带有标记的单细胞或细胞内颗粒物（如DNA、MPO、NE 等）荧光信号，从而实现高速、逐一的细胞定量分析。Masuda 等［36］基于流式细胞术，使用Sytox 染料对DNA 和MPO 共染色，鉴定了PMA 体外诱导中性粒细胞形成的纤维网状结构，但此方法不能识别细胞质膜完全破裂的细胞，相比显微成像分析数量有限，无法观察到细胞形态、结构以及定位荧光信号到特定部位等缺陷。 多谱段成像流式细胞仪（multispectral imaging flow cytometry，MIFC）是综合了荧光显微镜和流式细胞术的一种新型成像流式细胞仪，它可在多段波长同时捕获高速、高分辨率的图像，并进行大量悬浮细胞图像的采集，精确量化NETs形成中的细胞核形态变化，兼具量化分析和成像 的 优 点。Zhao 等［37］利 用MIFC 检 测DNA 染 色（Hoechst 染料）和MPO 的核位移，成功描述了NETs中细胞核的形态变化。以此为基础，Carmona-Rivera等［38］在研究脂多糖诱导形成NETs过程中，进一步描述了DNA解聚和MPO的核易位过程，结果显示在网状结构形成过程中细胞核面积增加，荧光强度降低。利用MIFC 检测NETs 具有清晰度高、敏感度高等优势，此外，还可提供明场、暗场的荧光图像、荧光强度和大量的细胞图像定量数据。但该法具有一定局限性，其一，网状结构形成期间的突出特征是核形态的变化，其直径通过染色质的解聚而显著增大，最终核物质几乎完全占据细胞质。在此过程中，染料插入DNA的强度降低，此方法依赖于细胞核在NETs 形成早期的形态变化。因此应避免对中性粒细胞长时间的刺激。其二，MIFC检测系统更注重于形变过程中的细胞，从而忽视已经溶解或处于形变后期的细胞。其三，在样品制备过程中，离心等操作会造成细胞核的伸长或质膜的破裂，导致完整的细胞核从细胞中释放，影响检测结果。

4 结语

当前主要通过形态学观察、游离DNA/NETs 和组蛋白、MPO、NE、细胞因子等蛋白质组分的量化分析对NETs进行评价，评价体系通常采用多种方法联合分析。其中，蛋白质印迹法和ELISA 常用于辅助鉴定NETs，随着显微技术和免疫荧光新技术的发展，免疫荧光分析、共聚焦显微技术、流式细胞术等方法在体外活细胞成像的运用使得纤维网状结构的可视化程度大大提高。它们在量化NETs 方面应用广泛，对网捕死亡及其他细胞死亡机制如凋亡或坏死的鉴别也最为可靠。目前，量化NETs的标准化实验程序尚不完善，仍然缺少明确区分NETs与其他细胞死亡形式残余物的鉴定标准。因此，更需要建立一种有效评价NETs的自动定量分析评价体系，这对深入探索不同疾病状态的NETs 结构特征和生理病理机制尤为重要。