氨基葡萄糖生物制造关键技术研究

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的衍生物，又称作N-乙酰-D-葡萄糖胺，化学名为2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。 N-乙酰氨基葡萄糖在酸性条件下可脱去乙酰基转化为氨基葡萄糖。 氨基葡萄糖广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，具有较大的市场需求。

目前，N-乙酰氨基葡萄糖的生产方法主要为甲壳素水解法， 通过使用强酸对生物中的甲壳素进行酸解，使其相互连接的β 键断裂，从而解离出N-乙酰氨基葡萄糖单体。 该方法存在强酸废液污染环境、水解条件强烈、虾壳蟹壳来源造成部分人群过敏等缺陷。 微生物发酵法是利用微生物代谢来合成GlcNAc，并将目标产物分泌到发酵液中的方法。 如Kim、Jin-Yeon 等（2019）通过代谢工程构建重组谷氨酸棒杆菌产生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）。为了构建产生GlcNAc 的基础菌株，分别从谷氨酸棒杆菌产生菌株13032 中删除编码N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶的基因nagA、nagB和nanE，重组菌株被命名为KG208。 此外，分别源自谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母的编码葡糖胺-6-磷酸合酶和葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶的基因glmS和gna1在几种表达载体中表达。 在glmS和gna1表达的几种组合中，在ilvC启动子控制下表达glmS和gna1的重组细胞在烧瓶培养物中产生1.77 g/L的GlcNAc 和0.63 g/L 的GlcNAc。 JP19990329648 涉及具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶（GlmU）活性的多肽，编码该多肽的DNA。 根据该发明，通过遗传重组技术能够大规模生产来自属于谷氨酸棒杆菌属的微生物的GlmU 多肽。 通过使用该酶，可以有效地生成尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺。 Jiang Zhu 等（2018）开发了一种全细胞生物催化过程，用于从N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）环境友好地合成氨基葡萄糖（GlcN）。其通过表达来源于极端嗜热古菌的几丁二糖脱乙酰酶（Dac）构建了重组大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌株作为有效的全细胞生物催化剂。为了增强GlcN 产生，最佳反应条件：枯草芽孢杆菌全细胞生物催化剂18.6 g/L，温度40 ℃，pH 7.5，GlcNAc 质量浓度50 g/L，反应时间3 h。 在上述条件下，GlcN 的最大质量浓度为35.3 g/L，3-L 生物反应器中的摩尔转化率为86.8%。 郑昭奕 (2018) 选用了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为对象进行代谢路径改造合成GlcNAc。 该论文主要进行了以下工作：1)通过过表达基因glnA对谷氨酸棒状杆菌代谢途径中加强谷氨酰胺合成途径表达， 增强GlcNAc 氨基供体谷氨酰胺合成，重组菌C.gW-SG 的GlcNAc 产量达到2.34 g/L。通过敲除基因poxB对副产物乙酸合成途径阻断并将GlcNAc 合成途径中关键酶基因gna1进行整合，重组菌C.gWBG-SGA 的GlcNAc 产量达到2.62 g/L；2)通过对GlcNAc 途径主要竞争途径中的关键基因pfkA进行弱化，采用了anti-sense RNA 和CRISPRi 两种方式进行。 弱化效果最好的是通过anti-sense RNA 进行弱化的菌株C.gWBG-SGAA1 的GlcNAc 产量达到3.11 g/L；3) 确定了菌株C.gWBG-SGAA41 发酵过程中诱导剂最优添加时间和添加浓度分别为接种后2 h 和0.8 mmol/L IPTG。 对发酵培养基中重要成分进行浓度优化，当葡萄糖质量浓度为85 g/L，玉米浆质量浓度为40 g/L，尿素质量浓度为5 g/L 时最为合适，菌株C.gWBG-SGAA1 达到4.48 g/L。CN201611001491.7提供了一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。采用该发明提供的方法制备氨基葡萄糖，反应条件温和、工艺路线简单、产物纯度高、适合大规模的工业化生产，非常适于推广应用CN201810302095.0 公开了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用， 其以谷氨酸棒状杆菌S9114 作为出发菌株，使用谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的穿梭表达载体pJYW-4 表达了乙酰氨基葡萄糖合成途径中的一个关键酶基因：来源于秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶GNA1，并通过在GNA1 基因的3′非翻译区插入重复性回文序列来加强乙酰氨基葡萄糖合成途径， 提高乙酰氨基葡萄糖的产量，得到了产乙酰氨基葡萄糖重组谷氨酸棒杆菌，产量达到6.1 g/L。

生物法制造氨基葡萄糖具有很多优点，如对环境污染小、产物得率高、反应条件温和、成本较低、生产时间较短等，市场应用前景广阔。 因此开发并构建高产N-乙酰氨基葡萄糖的食品安全级优良生产菌种，创建氨基葡萄糖的绿色高效生产技术体系，具有重要的意义。