小麦种质材料赤霉病抗性鉴定及遗传多样性分析

朱靖环，王其飞，华 为，徐 芹

(1. 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，浙江杭州 310021；2. 长江大学农学院，湖北荆州 434023)

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是威胁我国小麦生产安全和食品安全的重大病害之一[1]。它不仅会造成小麦严重减产，而且导致品质劣化，尤其是病原菌产生的毒素积累于病麦粒中，被食用后会对人畜产生毒害作用[2]。小麦赤霉病主要发生在长江中下游地区。近年来随着气候变化和耕作方式的改变，我国的小麦赤霉病日趋严重，已从长江中下游麦区蔓延至黄淮麦区、北方麦区和西部麦区[3]。因此，加强小麦赤霉病防控是确保我国粮食安全急需解决的主要问题。培育抗赤霉病品种是防治该病害既经济又环保的最有效手段，小麦抗赤霉病种质材料的鉴定和筛选是培育小麦抗赤霉病品种的先决条件[4]。

国内对小麦抗赤霉病种质资源的鉴定由来已久。20世纪70年代初，我国小麦赤霉病研究协作组历时10年对34 571份材料进行了鉴定，鉴定出抗赤霉病材料1 796份，其中高抗品种苏麦3号、望水白和繁60085等，中抗品种平湖剑子麦、温州红和尚、翻山小麦、苏麦2号等，成为我国乃至世界小麦赤霉病抗性品种培育的重要抗源[5]。徐乔乔等于2014-2017年鉴定了不同来源的45个小麦品种赤霉病抗性，其中13个品种至少2个年度表现抗病[6]。张煜等在2016-2018年对762个黄淮南部麦区小麦品种进行赤霉病抗性鉴定，发现15个品种表现中抗[7]。小麦赤霉病的抗性遗传较为复杂，属于多基因控制的数量性状，易受环境的影响[8]。育种上主要使用苏麦3号、望水白、黄方柱、海盐种、白三月黄和黄蚕豆等少数抗源材料，使得后代抗病品种遗传基础愈发狭窄。目前的抗源材料农艺性状普遍较差，育种上难以直接利用[9-10]。因此，鉴定并挖掘抗赤霉病的优异种质材料仍然是当前小麦抗赤霉病育种的重要任务。

小麦赤霉病鉴定主要采用土表病麦粒接种法和单花滴注病原菌孢子液接种法。土表接种鉴定能够揭示供试材料抗侵染和抗扩展的综合能力，操作简单粗放，适用于群体材料的初步筛选和鉴定。单小花滴注接种鉴定能够揭示供试材料的抗扩展能力，较为费时费力，适宜较少数量材料的精准鉴定[11-12]。SSR分子标记具有多态性好、共显性等诸多优点，广泛应用于分析小麦种质资源的遗传多样和品种间的遗传距离，可为杂交组合选配提供科学依据，有助于提高小麦的育种效率[13]。浙江省地处东南沿海，小麦灌浆成熟期雨水多、气温高，是我国赤霉病高发地带，赤霉病抗性是该地区小麦育种必须解决的首要目标。本研究将土表接种和单花滴注接种法相结合，对前期采用病麦粒土表接种法从345个小麦育成品种(系)中初步筛选出的表现抗病的94个小麦品种(系)进行再鉴定，并对其进行SSR分子标记遗传多样性分析，同时调查抗病品种(系)的农艺性状，以期为小麦抗赤霉病育种提供可靠有效的抗源。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试小麦赤霉病菌种为具有强致病力的F15-06、F15-08、F14-09，由浙江省农业科学院作物与核技术利用小麦育种团队分离、鉴定和繁存。2017-2018年通过病麦粒接种从345个小麦育成品种(系)初步筛选出94个抗病品种(系)。这94个品种(系)来源于8个省或直辖市，其中北京17个、陕西1个、河南3个、四川2个、安徽2个、江苏44个、上海4个、浙江21个(表1)。以苏麦3号、扬麦158和矮抗58分别作为高抗对照(CK1)、中抗对照(CK2)和高感对照(CK3)。所有的小麦试验材料由浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所小麦育种团队收集、繁存。

(续表1 Continued table 1)

(续表1 Continued table 1)

1.2 赤霉病抗性鉴定

抗病性鉴定试验在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所赤霉病鉴定圃进行。使用菌株F15-06、F15-08、F14-09混合土表接种和单小花滴注接种的鉴定方法参照国家农业行业标准《小麦抗病虫性评价技术规范：小麦抗赤霉病评价技术规范》(NY/T1443.4-2007)。2017-2018和2018-2019年的土表接种鉴定试验中，供试材料(包括3个对照品种)11月份田间播种，每个材料播1行，行长1.2 m，行距0.25 m，播种100粒，3次重复,随机排列。试验材料四周设保护行，播种感病对照品种矮抗58。在小麦抽穗前1个月分2次，前后相隔1周，将制备的大麦病粒均匀撒于小麦行间。每次接种量为60 kg·hm-2，接种后弥雾保湿1周。单花滴注接种于2018-2019年度进行，小麦田间种植方式同上。使用绿豆水培养基制备孢子悬浮液，稀释浓度为每毫升105个孢子，在小麦扬花初期(10%麦穗扬花)将20 μL孢子悬浮液注入麦穗中部的一个小花内，每份材料接种15穗，接种后弥雾保湿1周。

供试材料发病严重度分级调查和抗性评价均参照国家农业行业标准《小麦抗病虫性评价技术规范：小麦抗赤霉病评价技术规范》(NY/T1443.4-2007)，略有改动。在小麦乳熟中后期，土表接种鉴定的每个品种(系)的每个重复随机选择15个麦穗，调查其病情严重度，并计算病情指数；单花滴注鉴定的每个品种(系)的每个重复也随机选择15个接种穗，调查其病情严重度，计算平均严重度。抗病性评价划分为5个等级，分别为免疫(immune,I)、高抗(highly resistant,HR)、中抗(moderately resistant,MR)、中感(moderately susceptible,MS)和高感(highly susceptible,HS)。土表接种的抗病性鉴定标准：病情指数=0，免疫；0<病情指数<苏麦3号病情指数，高抗；苏麦3号病情指数≤病情指数<扬麦158病情指数，中抗；扬麦158病情指数≤病情指数<矮抗58病情指数，中感；病情指数≥矮抗58病情指数,高感。单花滴注接种参试品种(系)抗病性鉴定标准:平均严重度=0,免疫;0<平均严重度<2.0,高抗;2≤平均严重度<3,中抗;3≤平均严重度<3.5,中感;平均严重度≥3.5，高感。相同品种(系)土表接种鉴定抗性等级评价以2个年度中抗性表现较低的等级为准，相同品种(系)抗性的不同鉴定方法的抗病性评价以土表接种和单花滴注鉴定中表现较低的等级为准。

1.3 农艺性状调查

2018-2019年度将上述供试材料(对照品种扬麦20，浙江省小麦主栽品种)种植于浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所试验地，不接种赤霉病菌株，种植方式同抗病性鉴定，调查其单株分蘖数、株高、生育期、穗长、穗粒数、单株产量和千粒重。

1.4 遗传多样性分析

1.4.1 DNA提取

将94个小麦品种(系)及三个对照的种子种植于装有营养土的育苗穴盘中，在温室中催芽出苗，每个品种(系)分别取5～10片幼嫩叶片，采用CTAB法[14]提取每个品种单株的总DNA，利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA的浓度和纯度，并将每个样品的DNA浓度统一稀释为50 ng·μL-1，放-20 ℃保存备用。

1.4.2 SSR扩增及电泳检测

在GrainGenes 3.0数据库(http://wheat.pw.usda.gov/GG3)中挑选出260个均匀分布于小麦21条染色体上的SSR标记[15]，从参试材料中随机挑选8个来源不同的小麦品种(系)的DNA对这260对SSR引物进行筛选，共筛选出49对条带清晰且多态性明显的SSR引物用于检测供试材料(表2)。

PCR扩增的反应体积为10 μL。反应体系： 2×Taq PCR Mix(北京天根生化科技有限公司) 5 μL，10 μmol·L-1引物F和引物R各0.5 μL，50 ng·μL-1DNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性 30 s，55～65 ℃(根据不同引物而定)退火30 s， 72 ℃延伸 1 min，循环35次；72 ℃充分延伸 6 min，4 ℃保存。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，恒定电压130 V，电泳120 min，采用银染法染色检测扩增结果。

1.5 数据处理

SSR的扩增条带按照有和无的方法记录结果，在相同迁移率的位置，有条带记为“1”，无条带记为“0”，建立0/1格式的数据库，然后利用DataTrans 1.0软件对数据进行转换，利用PowerMaker V3.25软件进行遗传多样性分析和UPGMA聚类分析。UPGMA聚类图利用MEGA-X软件进行绘制。利用SPSS 24.0软件对8个农艺性状进行描述性统计分析。

2 结果与分析

2.1 小麦种质材料赤霉病抗性鉴定

2017-2018年度通过土表接种鉴定筛选到94个抗病小麦品种(系)，其中表现免疫的品种(系)3个，高抗品种(系)33个，中抗品种(系)58个。2018-2019年度对这94个品种(系)再次通过土表接种鉴定，筛选得到抗病品种(系)75个，其中高抗品种(系)19个，中抗品种(系)56个；感病品种(系)19个，其中中感品种(系)17个，高感品种(系)2个。2018-2019年度通过单花滴注接种法鉴定，供试材料中表现中抗品种(系)62个，中感品种(系)32个。综合2种不同方法的鉴定结果，94个供试材料中，中抗品种(系)51个，中感品种(系)41个，高感品种(系)2个。51份表现抗病的材料中，来源于江苏、浙江和北京的小麦品种(系)分别有29个、9个和8个，分别占抗病材料56.9%、17.7%和15.7%。

2.2 小麦种质材料的遗传多样性

2.2.1 基因多样性

利用49对SSR引物在97个品种(系)中共计检测出159个等位位点，每对SSR引物可以检测出2～7个等位位点，平均为3个，其中cfa2219、wmc627、wmc167和wmc59标记的多态性位点最多，均为7个。每个标记的基因多样性值为0.02～0.78，平均为 0.50；其中位于2B染色体上的wmc627标记具有最高的基因多样性，为0.78。此外，49个SSR标记的多态性信息含量(PIC)为0.02～0.75，平均为0.42；其中PIC值高于0.5的19个标记，为高度多态性位点(表2)。

表2 49对SSR标记名称和染色体位置及其在97份小麦种质材料中的多态性

2.2.2 聚类分析

利用SSR数据计算得到的97份小麦品种(系)相互间的遗传距离范围为0.02～0.74，平均为 0.35。根据遗传距离，利用非加权组平均法(UPGMA)对97个品种(系)进行聚类分析。结果表明，所有97个品种(系)可以划分为7个类群(图1)。Ⅰ类群包含20个品种(系)，其中中抗品种(系)16个，占抗赤霉病品种(系)总数的 31.4%；Ⅱ类群包含30个品种(系)，其中中抗品种(系)12个，占抗赤霉病品种(系)总数的23.5%，中抗对照扬麦158包含在该类群中；Ⅲ类群包含26个品种(系)，其中中抗品种(系)14个，占抗赤霉病品种(系)总数的27.5%；高抗对照苏麦3号被分在该类群；Ⅳ类群包含7个小麦品种(系)，其中中抗品种(系)2个，占抗赤霉病品种(系)总数的3.9%；Ⅴ类群仅含有1个中抗品种，占抗赤霉病品种(系)总数的2.0%；Ⅵ类群包含3个品种(系)，其中中抗品种(系)2个，占抗赤霉病品种(系)总数的 4.0%；Ⅶ类群包含10个品种(系)，其中中抗品种(系)5个，占抗赤霉病抗品种(系)总数的9.8%。抗病材料主要分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ类群，占抗赤霉病品种(系)总数的 92.2%；不同来源的抗病品种(系)分布在不同的类群中。

a：97个小麦品种(系)的编号,其中3个对照品种W001、W002和W003用橙色阴影凸显出来。b：小麦种质材料的抗病性，黑色五角星代表高抗，灰色五角星代表中抗；c：聚类分组情况。

2.3 抗病材料的农艺性状

51个表现中抗品种(系)农艺性状的变异较大(表3)。单株分蘖数平均为3.64个，变化范围为2.81～4.83个；平均生育期为186.12 d，变化范围为181.00～191.67 d；平均株高为80.97 cm，变化范围为71.67～90.33 cm；平均穗长为9.49 cm,变化范围为7.64～11.54 cm；平均穗粒数为39.87粒,变化范围为31.18～47.97粒；平均单株重量为6.66g,变化范围为4.44～8.96 g；平均千粒重为46.07 g，变化范围为37.33～ 56.85 g。51份抗病材料中，Y608、庆丰188、宁丰518、明麦7号、宁麦资15116、金运麦4号、zhb003、科运麦1611和华鉴麦3号等9个品种(系)的综合农艺性状表现优异，单株产量和千粒重分别都在7.5 g和45 g以上，株高在74.67～84.67 cm之间。

表3 51个抗赤霉病小麦品种(系)主要农艺性状统计分析

3 讨 论

小麦赤霉病是威胁我国小麦产业发展的重要病害之一，培育抗赤霉病新品种是克服小麦赤霉病的根本途径[16]。筛选和鉴定优异的赤霉病抗源是小麦抗病育种的基础，国内外的诸多学者针对小麦赤霉病抗源的筛选和鉴定已经开展了一系列的研究，但是当前的小麦育种中仍然缺乏可靠的FHB抗源[17-19]。目前全球范围内仅有苏麦3号及其衍生后代和来自巴西春小麦品种Frontana作为FHB主要抗源广泛应用于小麦的抗赤霉育种，少数几个抗源材料过度使用导致育种材料遗传背景愈发狭隘，小麦抗赤霉病育种在很大程度上不能满足小麦生产发展的需求[20-21]。因此，不断挖掘和鉴定小麦抗赤霉病材料丰富抗源的多样性，对于加快小麦抗赤霉病育种进程、提高小麦品种赤霉病持久抗性具有重要意义。

小麦赤霉病鉴定主要有土表病麦粒和单花滴注病原菌孢子液接种鉴定，病麦粒接种鉴定可鉴别病原菌抗侵染和抗扩展能力，单花滴注可鉴定病原菌抗扩展能力。病麦粒接种鉴定操作简单，但受环境的影响较大，单花滴注比较准确可靠，但工作量较大，且不能鉴定病原菌的抗侵染能力[11-12]。本研究综合两种鉴定方法的优势，首先采用病麦粒接种筛选抗赤霉病种质材料，再次通过病麦粒和单花滴注接种，综合鉴定小麦种质材料的赤霉病抗性。本试验对前期通过病麦粒土表接种筛选出的抗赤霉病品种(系)94个，第二年继续病麦粒土表接种，其中17个品种(系)感病，所鉴定的材料发病程度加大，原因可能在于第二年田间的气候条件有利于病害的发生。而对这94个材料进行单花滴注鉴定，有32个品种(系)感病，相比于病麦粒接种感病材料增加，说明单花滴注比较能够精细鉴定小麦种质材料的赤霉病抗性。了解种质资源的遗传背景有助于合理选配亲本组合，充分发挥杂交优势，增大后代群体的性状分离，提高育种效率。亲本的选配还需要考虑到其农艺性状表现，一般需要株高适中抗倒、生育期不宜太长、穗大粒多、分蘖强、丰产性好。本研究采用分子标记分析了供试的97份小麦种质材料(包括3个对照品种)的遗传多样性，将97份小麦种质材料划分为7个类群，鉴定到的51个抗赤霉病品种(系)分布在7个不同的类群中，因此对于抗病育种的杂交亲本选配应尽可能选择不同遗传类群的种质材料。本试验考查了51份抗赤霉病种质材料的单株分蘖数、株高、生育期、千粒重和单株产量，品种(系)间农艺性状的变异较大。其中包含在类群Ⅰ中的庆丰188、宁丰518、科运麦1611，类群Ⅱ中的宁麦资15116、zhb003、华鉴麦3号，类群Ⅲ中的Y608、明麦7号、金运麦4号，在抗赤霉病育种中杂交亲本选择中可作为重点关注对象。

鉴定到的51个抗赤霉病品种(系)在Ⅰ至Ⅶ这7个类群中的数量分别为15、13、14、2、1、1和5个，包含在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类群中的材料占材料总数的82.4%，抗赤霉病育种中被广泛使用的对照品种扬麦158和苏麦3号分别也包含在Ⅱ和Ⅲ类群中(图1)，说明本研究鉴定的抗赤霉病种质资源在很大程度上也存在亲缘关系较近和遗传背景狭窄的问题，与前人报道的结果相一致[20-21]。小麦赤霉病的抗性遗传较为复杂，属于多基因控制的数量性状，且易受环境的影响[8]。已经在小麦21条染色体上定位了250多个抗小麦赤霉病的QTL位点，但是绝大多数的QTL位点效应均不高且还有待验证[4,22]。目前已经明确的抗赤霉病基因位点有7个，分别为Fhb1[23-24]、Fhb2[24-26]、Fhb3[27]、Fhb4[28]、Fhb5[29]、Fhb6[3029]和Fhb7[31]。利用与已知抗赤霉病基因位点紧密连锁的分子标记，可检测抗病材料所含有的抗病基因，通过聚合不同的抗赤霉病基因位点，可选育出抗病性强而稳定的小麦品种。因此还需要进一步检测鉴定到的51个抗病材料所含有的抗赤霉病基因，从而利用分子标记进行抗赤霉病基因的聚合育种。