河南产猫爪草的质量分析研究

梁利香，周斌，乔新荣

(信阳农林学院，信阳市中药资源开发工程技术研究中心，信阳市中药质量分析检测重点实验室 ，河南 信阳 464000)

猫爪草为毛茛科植物小毛茛(RadixRanunculiTernati.)的干燥块根，性温，味甘、辛，归肝、肺经，功能化痰散结、解毒消肿，用于治疗瘰疬痰核、疔疮肿毒、蛇虫咬伤[1]。猫爪草含有多种成分，如糖类、黄酮类与苷类、氨基酸、生物碱苷类、有机酸、甾醇及酯、挥发油和微量元素等，具有抗结核、抗菌、抗癌、免疫调节作用、保护性抑制作用、抗氧化作用等多种药理活性[2]。猫爪草近年来由于其抗肿瘤活性备受人们的关注，诸多实验研究表明猫爪草多糖(PRT)是其抗肿瘤、抗氧化、保肝、调节免疫的活性成分[3-8]。河南猫爪草种植和产量在全国占有重要地位，尤其信阳地区既是猫爪草的发现地和野生分布区，又是目前国内猫爪草的主要栽培区。为了更好控制河南猫爪草质量，本文按照《中国药典》(2015年版)对河南产猫爪草从性状鉴别、横切面显微鉴别、薄层色谱鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分检查和稀乙醇浸出物测定等方面进行了研究，并增加粉末显微鉴别、粗多糖和多糖含量测定项目。以期为河南产猫爪草的质量控制、河南产猫爪草的道地性、原产地标记的认定、资源开发和质量控制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料 猫爪草药材从不同产地收集，由信阳农林学院、信阳市中药质量分析检测重点实验室鉴定为毛茛科植物小毛茛(RanunculusternatusThunb.)的干燥块根。样品信息见表1。

1.1.2 试剂 无水葡萄糖标准品(中国计量科学研究院，批号为GBW1006213001,含量为99%)；酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、无水硫酸钠、氢氧化钠、盐酸、乙醇、正丁醇、无水乙醇、冰醋酸等均为分析纯，纯化水自制。

1.1.3 仪器 TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；AB-135-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器制造有限公司)；SCQ -8201E 超声清洗仪(上海声彦超声波仪器设备有限公司)；Carl Zeiss Primo Star可摄像生物显微镜(德国卡尔蔡司公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制备

1.2.1.1 葡萄糖标准溶液的配制 将葡萄糖对照品干燥至恒重，精密称定0.1042 g 于100 ml容量瓶中，加纯化水充分溶解后，稀释至刻度，摇匀，制得葡萄糖标准溶液。

表1 猫爪草样品信息

1.2.1.2 标准曲线的制备 精密移取上述葡萄糖标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于6只100 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀后得葡萄糖对照品溶液。

精密称取蒽酮0.1 g，加100 mL硫酸溶解，摇匀后即得硫酸蒽酮溶液。

分别精密移取各对照品溶液1.0 mL于10 mL具塞试管后，将试管置冰水浴中，迅速加入4.0 mL 硫酸蒽酮溶液。再将试管置沸水浴中显色10 min后，取出置冰水浴中冷却10 min，然后将试管在室温下放置 10 min。同时移取1.0 mL纯化水，同法操作，作为空白溶液。按照紫外-可见分光光度法[9]，在625nm处测其吸光度。以浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标，绘制成标准曲线，得回归方程为A=0.01037C + 0.00907(r=0.9994)。结果表明：葡萄糖在10.42～62.52μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.2 猫爪草中多糖的含量测定

1.2.2.1 供试品溶液的制备 猫爪草药材各样品粉碎后，过60目筛网。取每种样品粉末1.5g，各取3份。每份加约0.045g的α-淀粉酶和3倍量的纯化水进行酶解。酶解温度为 50℃，酶解溶液pH为6 ，酶解时间设为40min。酶解结束后，再加7倍量纯化水超声提取20 min，超声功率为300 W。然后进行抽滤。滤渣再加纯化水超声提取2次，每次加水量为8倍量，每次提取时间为20 min，合并3次经酶解、协同超声提取所得的提取液，将其浓缩至原体积的1/2 , 过滤，弃去前滤液10 mL，收集续滤液。精密移取续滤液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加纯化水至刻度，即得供试品溶液。

1.2.2.2 多糖溶液的制备 精密移取1.2.2.1项下猫爪草总糖续滤液10 mL于50 mL烧杯中，60℃条件下干燥。干燥后，加入1 mL纯化水溶解，边搅拌边加入10 mL无水乙醇，静置30min后，过滤，将沉淀全部转移至滤纸上，用纯化水-无水乙醇(1：10)的溶液洗涤沉淀3次。将带滤纸的漏斗移至 25 mL的容量瓶上，多次用纯化水冲洗将沉淀完全溶解加入容量瓶中，加纯化水至刻度，即得多糖溶液。

1.2.2.3 多糖含量测定方法 精密移取各供试品溶液1.0 mL于10 mL具塞试管中，下起同标准曲线的制备项下“置冰水浴中”，测定其吸光度，并计算其含量。

1.2.3 薄层色谱实验 分别吸取供试品溶液、对照药材溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-无水乙醇-冰醋酸-水(8：2：2：3)为展开剂展开后，取出晾干，再喷以茚三酮试液，热风吹薄层板至斑点显色清晰。

2 鉴别结果

2.1 来源鉴别

猫爪草为一年生草本，多生长在光照充足的路边、山脚、田野、溪边和湿润的草地。粗短的根茎上着生簇状的块根。茎较柔软纤弱，铺散，高5～20 cm。基生叶丛生，叶柄长，叶片幼小时多单叶，近全缘，基部近心形。后逐渐至浅裂、3深裂或多次狭细分裂。茎生叶近无柄，且叶片多分裂成3～5狭长条状裂片。茎多分枝，花单生茎顶端和分枝顶端，直径1～1.8cm，萼片5～7枚，外表皮上着生稀疏的柔毛。花瓣5～8枚，多5枚，初开时亮黄色，逐渐变为白色。栽培大田中出现少数黄、白色块夹杂的花朵情形。花托外表面无毛。聚合果近似球形，瘦果卵形。早春3月开花，果实5～6月成熟。果实成熟后地上部分逐渐枯萎。见图1、图2。

图1猫爪草初开放的花 图2少数猫爪草的花黄白色块夹杂

2.2 性状鉴别

猫爪草实际入药部位由粗短的根茎及根茎上数个至数十个纺锤形簇生的块根组成，形似猫爪，顶端有黄褐色残存的茎或茎痕。表面黄褐色至灰黄色，略有纵皱纹，并有点状须根痕或残留须根。质坚实，断面白色或黄白色，多实心，偶见有裂隙，粉性。气微，味微甘。见图3。

2.3 显微鉴别

2.3.1 横切面显微鉴别 根茎皮层分布有数个须根维管束，木质部和韧皮部相间排列。块根的表皮细胞切向延长，黄棕色，有的分化为表皮毛，微木化。皮层由20～30列细胞组成，壁稍厚，有纹孔，内皮层明显。中柱小，木质部、韧皮部各2～3束，间隔排列。薄壁细胞充满淀粉粒。结果见图4、图5。

图3猫爪草药材图 图4猫爪草须根维管束显微图 图5猫爪草横切面显微图

图6猫爪草粉末显微特征图

2.3.2 粉末显微鉴别 本品粉末淡棕色至黄棕色。导管多为具缘纹孔导管和螺纹导管，木质化。具缘纹孔导管纹孔较为密集，宽25～100μm，有的末端斜尖；螺纹导管宽为10～35μm。管胞木化，具缘纹孔密集，宽7～15μm，长120～350μm。表皮细胞狭长，横切面观，宽6～12μm，长85～178 μm，黄棕色，最外层表皮细胞多分化为基部宽，上部呈窄长的毛状。表皮毛非木化，上部宽8～15 μm，有的有分支和多个横隔，多断裂。皮层细胞横切面观卵圆形、类三角形或圆形，直径20～188 μm，纵切面观圆柱形，长107～350 μm。壁较厚，上有稀疏排列的狭长单纹孔，上下横壁上网状纹孔密集。皮层细胞充满淀粉粒。淀粉粒单粒呈球形、类球形或成多面锥体，直径8～25μm，脐点点状。淀粉粒多为多面锥体，低倍镜下观察，脐点如十字形、人字形或星芒状。块根根尖组织细胞类长方形、类方形或卵圆形，直径70～100 μm，棕色或无色，有的可见稀疏的细小点状纹孔，内含深棕色核状物(见图6)。

偶尔可以看见茎叶等地上部分混淆进去的粉末特征。如气孔，多为不定式或环式；非腺毛，有分枝；或分泌组织。见图7。

2.4 薄层色谱鉴别

色谱实验结果见图8。1～4样品供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.5 多糖含量测定结果

猫爪草中多糖含量的测定结果见表2。

表2 猫爪草中多糖含量(n=3)

表2(续)

由表2可知，河南信阳地区猫爪草的多糖含量为30.78%(n=6，RSD=4.27%)。用单因素方差分析得其与商丘(样14)、周口(样15)、平顶山(样16)和开封(样17)不具有显著性差异(p>0.05)，但其分布量较大，且与其余7个采样点(7-13)差异显著(p<0.01)。

3 结论与讨论

试验结果表明：河南不同产地猫爪草的性状、块根的横切面显微特征、TLC鉴别基本一致，无显著差异；河南不同产地猫爪草多糖的含量差异明显，以河南信阳淮滨产猫爪草多糖的含量最高，河南信阳淮滨和息县产猫爪草中多糖的含量无明显差异，但均高于其它地区。为信阳是优质高效的猫爪草道地药材产区提供了一定的判断依据。

猫爪草根顶端应为粗短的根茎，但因须根较多，簇生的块根也较多，本研究所做横切片还不十分满意，需要进一步观察研究。猫爪草入药时常含有少量非入药部位，观察粉末显微特征时要注意区分。大田栽培的猫爪草的花出现黄白夹杂色块的原因需要进一步探明。

猫爪草的采收期通常为5月上旬，本试验中17个产地猫爪草多糖含量的平均值的80%为23.25%。多糖含量是否与采收时间、地域、气候、土壤环境、生长年限、种植方式等有关，有待进一步研究。