温度胁迫对枣实蝇蛹体内主要抗氧化物酶的影响

李岚洁，阿地力·沙塔尔

(新疆农业大学林学与园艺学院林学系,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】温度是影响昆虫生长、发育、生殖及存活等生命活动最重要的因素[1]，适宜温度是昆虫完成正常发育的重要条件，温度过高或过低，都会对其产生不利影响[2]。温度胁迫是指生物对于正常生长温度之外的反应[3]。实蝇类昆虫危害严重性与其强大的环境适应能力紧密相关，研究发现实蝇类昆虫可通过消耗体内的能源物质或增强相关酶的活性来抵抗外界环境温度的胁迫[4]。夹福先[3]等对桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel) 抗热胁迫反应测定发现，该实蝇有较强的温度适应能力与其体内氧化酶的调节能力有关；而瓜实蝇Bactroceracucurbitae(Coquillett) 遭受高温处理时虫体为了保持体内生理机制平衡，利用消耗体内储存物质来维持虫体正常工作，从而导致体内能量物质含量下降，最终因物质失衡死亡[5]。枣实蝇(CarpomyavesuvianaCosta)是我国出入境检疫性有害生物，在我国仅分布于新疆吐鲁番[6]。吐鲁番地区气候干旱，昼夜温差大，夏季温度极高，冬季温度极低，这种极端温度会对枣实蝇的生长繁殖产生重要影响。实蝇类昆虫温度胁迫耐受性研究已成为当前昆虫学研究中的一个热点。【前人研究进展】国内外对枣实蝇的研究集中于生物生态学特性观察、防治及快速检测等领域[7-12]。【本研究切入点】枣实蝇作为外来入侵物种，其传入新入侵地吐鲁番后如何适应夏季的极端气候环境的与能力尚不清楚。MDA(丙二醛)是反映昆虫体内生理生化的重要指标之一，MDA含量越高说明昆虫受到的氧化伤害越强烈；抗氧化酶系统(CAT、POD、SOD以及T-AOC)是维持昆虫体内生理动态平衡的关键因素，当昆虫遇到环境压力时，激发体内抗氧化酶系统来缓解环境压力带来的伤害。研究枣实蝇在吐鲁番高温的适应性机制。【拟解决的关键问题】测定高温下枣实蝇蛹体内MDA含量及抗氧化酶活性，研究枣实蝇蛹在温度胁迫下的生理反应机制，为预测枣实蝇分布区、模拟种群动态、评估其地理扩散能力等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试虫源

供试虫样采自于新疆吐鲁番市亚尔乡亚尔谷力村(42°37′54″N，90°45′38″E)枣园中带有枣实蝇幼虫的新鲜枣果，采集后带回室内，将带虫的枣果置于细沙上，当幼虫从枣果中自然脱果后待幼虫化蛹。将同一日龄的蛹放入盛放有10 cm细沙的圆柱形容器内放入温度(28±1)℃。相对湿度(40±5)%，L∶D=14∶10(h)的条件下培养备用。

1.1.2 仪器

XMark全波长分光光度计(Bio-Rad)、MDF-382E(N)超低温冰箱(SANYO)、MIR-154三洋恒温培养箱(SANYO)、Himac CF 16RX 冷冻离心机(HITACHI)、涡旋振荡仪(Labnet)、Elix-5+30L纯水系统(Millipore)、移液器(Eppendorf)、YCD-EL259医用冰箱(中科美菱)、RXZ型智能PQX型多段人工气候箱(宁波东南仪器有限公司)、DK-8D三孔电热恒温水槽(上海齐欣科学仪器有限公司)、FA2004A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)。

1.1.3 试剂(盒)

试剂：牛血清蛋白BSA(上海博奥生物科技)、氯化钠NaCl、冰乙酸Aceticacid、乙醇Ethanol(均为成都市科龙化工试剂厂生产)、考马斯亮蓝G-250(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

试剂盒：过氧化氢酶(Catalase CAT)测定试剂盒(可见光法)、丙二醛(MDA)测定试剂盒、血清(浆)组织过氧化物酶(POD)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒以及总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 试剂配制

(1)1 000 μg/mL牛血清蛋白(BSA)标准溶液：0.1 g牛血清蛋白溶于100 mL MilliQ H2O中，4°C短期保存。

(2)G-250 贮液：0.1 g G-250 充分溶解于50 mL 90%乙醇后加100 mL 85%(W/V)的磷酸，MilliQ H2O定容至1 000 mL，室温下保存30 d。

(3)0.9%生理盐水：称量9 g NaCl溶于1 000 mL水中，充分溶解；各试剂盒中的试剂配制根据说明书操作。

1.2 方 法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 酶液提取

分别将每30头枣实蝇的蛹置于45、43、41、37、33、28(CK)、4、0℃(高温胁迫范围以枣实蝇蛹的临界高温39～42℃为中心设定；低温胁迫范围设定参照夹福先[3]的方法)下的人工气候箱内胁迫饲养，胁迫时间分别是3、6和9 h。胁迫后置27℃下恢复30 min，挑取存活的蛹(蛹体表面有光泽的定义为活蛹)，置于液氮迅速冷冻，研钵研磨至粉末。称取一定粉末，加9倍生理盐水制成10%的组织匀浆液，4℃、2 500 r/min，离心15 min后取上清液，继续同条件离心10 min，收集上清液，分装后-80°C超低温冰箱保存备用。

1.2.1.2 样品定量

根据Bradford[13]的方法，蛋白样品定量之前先制作G-250的标准曲线。在96孔酶标板上加样后在XMarkTM全波长分光光度计中25℃中震荡120 s，在595 nm波长读取每孔的OD值。根据G250染色法的测定结果，求得牛血清蛋白含量与OD值，标准曲线为y=0.107x+0.239 1 ,R2=0.957 3，其中y代表OD值，x代表蛋白含量，单位为μL。根据所测试的枣实蝇体内酶液的OD值，计算出不同温度处理下的枣实蝇成虫及蛹的蛋白含量。表1,图1

表1 G-250标准曲线制作Table1 Drafting of standard curve of G-250

样品(μL)123456100 μg/mL(BSA)0246810MilliQ H2O504846444240G-250200200200200200200

标准曲线制作完毕后，以生理盐水为对照，对蛋白样品进行定量。

图1 枣实蝇虫体蛋白质含量测定标准曲线
Fig. 1 Standard curve ofCarpomyavesuvianapapus protein

1.2.2 MDA含量测定

根据测定试剂盒的说明书，MDA含量的测定参照夹福先[3]的方法进行操作。加样后用涡旋振荡仪混匀，95℃水浴40 min，流水冷却，3 500～4 000 r离心10 min，取上清液，混匀后，在532 nm下测定OD值，各处理取供试蛹20头，重复3次取平均值。

1.2.3 保护酶活性测定

根据蛋白含量测定结果和试剂盒要求，测定CAT、SOD活性均使用的是10%的组织匀浆液。按照测定试剂盒的说明书，POD、CAT、SOD和T-AOC活性的测定分别取空白管和测定管两个处理，具体参照夹福先[3]的方法，重复3次取平均值进行操作。

1.3 数据处理

用SPSS19.0软件对枣实蝇体内MDA含量和其他抗氧化物酶活性的差异进行分析。采用One-way ANOVA/Duncan＇s法进行方差分析和显著性测定，显著性水平P=0.05。

注:28℃为对照柱形图数值表示平均值±SE；柱上方不同字母表示显著性差异，P<0.05，LSD，方差分析；图A、B和C分别表示胁迫时间设置3个处理：3、6和9 h

Note:28℃ served as a control. Each value represents the mean(=SE) of three replications. Different letters topped on the bar designated significant difference atP<0.05 in ANOVA (LSD).
Table A、B and C represented treatment duration of 3, 6 and 9 h, respectively

图2 不同温度处理下枣实蝇蛹体内MDA含量变化
Fig.2 MDA content ofCarpomyavesuvianapapus at different temperatures

2 结果与分析

2.1 不同温度处理对枣实蝇蛹内MDA含量的影响

研究表明,胁迫温度(P<0.05)和胁迫时间(P<0.05)均对枣实蝇蛹体内MDA含量具有显著的影响。两者协同作用对枣实蝇蛹体内MDA含量也存在显著影响。不同胁迫温度和胁迫时间下，对照28℃枣实蝇蛹体内MDA含量最低。在低温区0～4℃，随着时间的延长，MDA含量值逐渐降低，但降低趋势不显著，0℃下MDA含量在9 h最低为(0.039±0.012) U×mg/protein。33～37℃随着温度升高和时间延长MDA含量先升高后降低，且差异显著。在高温区41～45℃随着温度的上升和时间的延长，3～6 h时MDA含量逐渐降低，并且有显著差异；9和6 h几乎没有差异。当45℃ 9 h时MDA的含量值最小为(0.041±0.015)U×mg/protein，仍然大于对照值。 图2

2.2 不同温度处理对枣实蝇蛹保护酶活性影响

2.2.1 POD活性

研究表明，胁迫温度(P<0.05)和胁迫时间(P<0.05)均对枣实蝇体内POD的活性影响显著。两者协同作用对枣实蝇蛹体内POD的活性也存在显著影响。在低温区，0～4℃随着时间的延长，POD的活性值也逐渐增长。在4℃不同胁迫时间下6 h POD活性值最高为1.228 (U×mg/protein)；但在6～9 h的4℃时POD活性有下降的趋势。在不同时间梯度下热胁迫后各处理组的POD活性会出现两个峰值，分别是0和41℃。在同一处理时间内这两个温度的POD值都比其他温度高。28～37℃随着温度升高POD活性伴随处理时间的延长呈现先增后减的趋势。在高温区41～43℃随着胁迫时间的延长POD活性先升高后降低。在温度达45℃时随处理时间的增强POD值出现了递减的趋势，在6和9 h POD的值低于对照9 h 28℃的POD活性值(0.602±0.015)U×mg/protein，长时间的胁迫对枣实蝇蛹体内的保护酶产生强烈伤害，而无法调节45℃以上的高温。 图3

注:28℃为对照柱形图数值表示平均值±SE；柱上方不同字母表示显著性差异，P<0.05，LSD，方差分析；图A、B和C分别表示胁迫时间设置3个处理：3、6和9 h

Note:28℃ served as a control. Each value represents the mean(=SE) of three replications. Different letters topped on the bar designated significant difference atP<0.05 in ANOVA (LSD).
Table A、B and C represented treatment duration of 3, 6 and 9h, respectively

图3 不同温度处理下枣实蝇蛹体内POD活性变化
Fig.3 POD activity ofCarpomyavesuvianapapus at different temperatures

2.2.2 CAT活性测定

研究表明，胁迫温度(P<0.05)和胁迫时间(P<0.05)均对枣实绳蛹体内CAT的活性具有显著影响。两者协同作用对枣实蝇蛹体内CAT的活性也有显著的影响。不同胁迫温度和胁迫时间下，对照28℃枣实蝇蛹体内CAT活性最低。随着胁迫时间和胁迫温度同时升高，CAT的值明显出现两个峰值，分别是9 h 4℃和3 h 41℃，在不同时间梯度，这两个温度下的CAT活性都较其他温度高，在9 h 4℃最高值可以达到(3.604±0.015)U×mg/ protein。在低温区0～4℃随着时间的延长，CAT活性变化呈现不同程度升高趋势，且这种增长趋势在中温区28～37℃增长差异不显著。在高温区43～45℃的处理条件下随着时间的延长，CAT活性值逐渐降低，但其值仍高于3 h对照(1.009±0.015)U×mg/protein。在45℃下，3 hCAT的活性值最高为(2.113±0.015)U×mg/protein，9 hCAT活性值最低为(1.431±0.015) U×mg/ protein。枣食蝇蛹已经无法通过增加CAT活性来抵御外界高温，达到枣食蝇临界高温。

注:28℃为对照柱形图数值表示平均值±SE；柱上方不同字母表示显著性差异，P<0.05，LSD，方差分析；图A、B和C分别表示胁迫时间设置3个处理：3、6和9 h

Note:28℃ served as a control. Each value represents the mean(=SE) of three replications. Different letters topped on the bar designated significant difference atP<0.05 in ANOVA (LSD).
Table A、B and C represented treatment duration of 3, 6 and 9h, respectively

图4 不同温度处理下枣实蝇蛹体内CAT活性变化
Fig.4 CAT activity ofCarpomyavesuvianapapus at different temperatures

2.2.3 SOD活性测定

研究表明，胁迫温度(P<0.05)和胁迫时间(P<0.05)均对枣实绳体内SOD的活性具有显著的影响。两者协同作用对枣实蝇蛹体内SOD的活性也存在显著影响。不管是低温还是高温胁迫后枣实蝇蛹体内SOD的活性值均高于对照28℃3hSOD的活性值(0.421±0.021) nmol/mg protein。在低温区随着处理时间的延长，0℃SOD活性出现先降低后升高的趋势。在中温区随着温度的升高，SOD的活性值随着胁迫时间的延长呈增长的趋势。温度到37℃以上枣实蝇蛹内SOD的活性逐渐升高，到达41℃ 9 h SOD活性值达到最高，在高温区43～45℃ SOD活性变化随着胁迫时间的延长呈现降低的趋势，45℃胁迫时间达9 h后SOD活性值降低为(0.517±0.021) nmol/mg protein。此时的高温处理已经达到枣实蝇蛹的生理承受极限。 表2

表2 不同温度处理下枣实蝇蛹体内SOD活性变化
Table 2 SOD activity ofCarpomyavesuvianapz papus at different temperatures

温度Temperatures(℃)SOD活性SOD activity(nmol/mgprotein)3 h6 h9 h01.503±0.032d0.617±0.016ab1.033±0.026b40.642±0.035ab 1.034±0.052c1.169±0.021c280.421±0.021a0.423±0.023a0.435±0.027a330.531±0.013ab0.743±0.056b1.014±0.021ab371.239±0.064b1.503±0.036b1.036±0.042b411.536±0.035d2.310±0.018d3.074±0.021d430.571±0.027ab0.534±0.031a0.521±0.032a450.892±0.039b0.617±0.042a0.517±0.021a

注：不同小写字母表示在5%显著水平下各处理组之间差异显著(P<0.05)

Note: Different lowercase letters indicated significant differences between treatment groups at 5% significant level(P<0.05)

2.2.4 T-AOC活性测定

研究表明，胁迫温度(P<0.05)和胁迫时间(P<0.05)均对枣实蝇T-AOC活性有显著的影响,两者协同作用对枣实蝇蛹内T-AOC的活性也有显著的影响。不同胁迫温度和胁迫时间下，对照28℃枣实蝇蛹内T-AOC的活性最低。在各胁迫温度和处理时间下T-AOC的活性值在41℃均达到最高，33～37℃处理下随着时间的延长，T-AOC的活性变化不显著；在低温区0～4℃，T-AOC的活性值随处理时间的延长呈现降低的趋势；43～45℃的T-AOC的活性随着处理时间的延长明显降低，且显著性差异，但仍高于对照。枣实蝇蛹在遭受高温胁迫时通过增强总抗氧化酶的活性来增强对高温的抵抗能力，但这种抵抗能力在45℃以后开始减弱。图5

注:28℃为对照柱形图数值表示平均值±SE；柱上方不同字母表示显著性差异，P<0.05，LSD，方差分析；图A、B和C分别表示胁迫时间设置3个处理：3、6和9 h

Note:28℃ served as a control. Each value represents the mean(=SE) of three replications. Different letters topped on the bar designated significant difference atP<0.05 in ANOVA (LSD). Table A、B and C represented treatment duration of 3, 6 and 9h, respectively

图5 不同温度处理下枣实蝇蛹体内T-AOC活性变化
Fig.5 T-AOC activity ofCarpomyavesuvianapapus at different temperatures

3 讨 论

研究结果表明,不管是高温胁迫还是低温胁迫都会使枣实蝇蛹体内MDA含量及氧化酶活性呈现出显著性差异，温度胁迫导致枣实蝇蛹体内MDA含量升高，脂质过氧化的水平(LPO)上升，温度胁迫对枣实蝇蛹体内造成了严重的氧化胁迫；但随着胁迫时间的延长，MDA含量能够恢复到接近正常的水平，枣实蝇蛹体内的抗氧化系统能够有效地抵御热胁迫造成的氧化胁迫伤害。其中SOD、CAT和POD活性随着时间延长显著升高，在抵抗热胁迫造成的氧化胁迫中发挥着积极的作用。通过研究高温胁迫对枣实蝇蛹体内生理生化反应，产生了极其重要的影响。刘国花等[15]研究低温胁迫下尾巨桉幼苗的生长受到抑制，适当浓度的外源钙可以减缓低温胁迫对幼苗造成的伤害，提高桉树幼苗对低温胁迫的适应能力，故研究温度胁迫对动植物生理生化反应具有极重要的影响。

丙二醛(MDA)是多元未饱和脂肪酸过氧化反应的主要氧化产物[16]。在研究中，不论是低温胁迫还是高温胁迫，枣实蝇蛹体内MDA的含量都较对照显著升高，热胁迫提高了枣实蝇体内的脂质过氧化水平，造成了氧化伤害，而这种现象在自然界中是非常普遍的[17,18]。MDA活性值最大是在0和41℃，说明此温度下温度胁迫对枣实绳造成了严重的氧化胁迫，枣实蝇蛹运用体内的抗氧化物酶升高来抵御热胁迫的伤害。在41～45℃MDA的活性值随着时间的增长逐渐降低，当45℃处理9 h较该温度下处理3、6 h，MDA含量开始下降，吐鲁番夏季极端最高气温可达48.3℃，但枣实蝇蛹的亚致死高温区位于39～42℃，其中约有20%的种群可以抵御45℃的短时高温[19]，45℃已经达到了枣食蝇蛹的临界高温。

过氧化氢酶CAT只有在过氧化氢浓度很高的时候才发挥作用，低浓度下是沉默的[20]。研究中各胁迫温度下枣实蝇蛹的CAT活性值都较对照高，但是在低温区升高趋势不明显，在高温区41～43℃不同处理时间下的CAT活性值均明显降低，并出现显著性差异。枣食蝇能够在有极端天气的吐鲁番等地存活，可能与该实蝇抗氧化酶活性能够迅速升高有直接原因。

昆虫体内还有POD分解过氧化物[21]。研究中，各胁迫温度下的POD活性都较对照有所降低。但从POD活性的值来看，在4℃/6 h POD活性值最高为1.228(U×mg/protein)，但在不同时间梯度内，高温区内各温度值都高于对照，说明在POD已经发挥自己的作用，即使是在高温区，比对照的POD活性值低，但是低的非常小。尽管热胁迫后POD活性有所降低，POD依然较为稳定地发挥着作用，抵御不良环境带来的胁迫伤害。

SOD是自然界中所有抗氧化物中最重要的细胞内抵御氧化胁迫的抗氧化酶[22]，在清除由于极端温度所导致的高浓度超氧化物自由基的生理过程中发挥着重要的作用[23]。研究中枣实蝇的蛹SOD活性在各胁迫温度下都较对照显著升高，说明温度变化诱导了枣实蝇的蛹利用SOD活性的升高来保护自己免受氧化压力的伤害。且在高温区SOD的活性随着时间的延长有降低的趋势，此时的高温处理已经达到枣实蝇蛹体内的生理承受极限。

T-AOC的测定作为评价生物体内氧化还原反应的状态以及总的抗氧化能力水平的工具已被广泛应用[24-26]。研究中，在低温区0～4℃和高温区41～45℃的T-AOC活性值都明显高于对照，并形成显著性差异，热胁迫后，枣实蝇蛹的总抗氧化能力发生了极大的变化，T-AOC以较高的活性值发挥着其重要的抗氧化作用，枣实蝇的蛹通过自身体内的氧化还原反应来抵抗热胁迫带来的伤害，枣实蝇的蛹对极端环境有极强的耐受能力，但这种抵抗能力在45℃以后开始减弱。

枣实蝇发生在吐鲁番，吐鲁番的夏季高温可以到达40℃以上，而冬季最低温出现在1月平均温度仅-7.6℃，而枣实蝇蛹的平均过冷却点为-16.87℃，平均体液结冰点为-14.13℃，枣实蝇越冬虫态蛹个体过冷却点最低值为-18.16℃[19]，枣实蝇蛹体内的抵御机制已经能完全抵制此热胁迫和低温胁迫下的危害。史彩华等[27]研究报道两种色型棉蚜的存活率与胁迫温度及时间有显著关系。但枣实蝇蛹的存活情况与胁迫温度、时间的关系需进一步探究。

4 结 论

不管是高温还是低温胁迫都会使枣实蝇蛹体内MDA含量及氧化酶活性呈现出显著性差异。不同温度胁迫处理下，枣实蝇蛹体内MDA含量较CK(28℃)显著升高，但随着胁迫时间的延长，MDA含量能够恢复到接近正常的水平；各CAT、POD、T-AOC、SOD的活性值测定结果显示，在低温0、4℃和高温41℃处理9 h下出现3个高峰，在高温区43～45℃随着时间的延长，活性值逐渐降低，但是都高于CK，稳定地发挥着抗氧化胁迫的作用。枣实蝇蛹通过调节体内主要的抗氧化物酶活性，能够有效地抵御热胁迫造成的氧化胁迫伤害，但长时间的胁迫可对枣实蝇蛹体内的保护酶产生强烈伤害，而无法调节45℃以上的高温。