卵巢上皮性恶性肿瘤患者T淋巴细胞相关细胞因子与顺铂耐药的相关性

韩钦维 吴智玉 吴金萍 刘瑾华 白 丹 杨丽娜

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，以上皮性卵巢癌最为常见[1]。早期卵巢癌无特异性症状，多数在晚期才被发现，>70%的患者在确诊时已处于国际妇产科协会(FIGO)分期Ⅲ或Ⅳ期，发生腹腔内广泛转移[2]。卵巢癌的治疗包括手术、化学治疗(简称化疗)和放射治疗(简称放疗)，目前新的治疗方法包括基因治疗、血管生成抑制治疗和免疫治疗，但疗效均不确切[3-5]。化疗是卵巢癌治疗的重要手段，多数患者术后需辅助化疗。铂类药物和紫杉醇是治疗卵巢癌的标准化疗方案[6-7]。在化疗初期，患者的治疗敏感率约为80%，但随着化疗时间的延长，多数患者对化疗药物产生耐药，导致预后不良[8]。

在对抗肿瘤的过程中，细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要形式。T淋巴细胞亚群可产生众多细胞因子，在免疫细胞对抗肿瘤和免疫应答过程中发挥作用[9-10]，其中有4种细胞因子在激活细胞免疫和诱导机体对抗肿瘤方面发挥重要作用。如IL-2可刺激细胞毒T细胞(CTL)的杀瘤活性，IFN-γ是较强的免疫调节和抗肿瘤因子，TNF-α可诱导肿瘤细胞的凋亡等[11-12]。近期研究[13-14]发现，免疫微环境中的IFN-γ等细胞因子是机体对抗肿瘤的重要因素，在肿瘤耐药性的形成过程中发挥重要作用。本研究通过分析卵巢癌患者的顺铂耐药与血清T淋巴细胞相关细胞因子水平的相关性，旨在探讨顺铂刺激对机体淋巴细胞，尤其是CD8+T淋巴细胞功能的影响，以及T淋巴细胞相关细胞因子在顺铂耐药过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本采集 选择2010年5月—2018年1月西安市兵器工业卫生研究所妇产科收治的37例卵巢上皮性恶性肿瘤患者，年龄38～69岁，平均年龄为(54.00±13.11)岁。患者入院后均接受肿瘤细胞减灭手术联合顺铂的化疗，手术当日留取肿瘤标本进行化疗药物的耐药性检测和T淋巴细胞相关细胞因子的检测。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 检测顺铂耐药性 采用ATP生物荧光肿瘤体外药物敏感检测(ATP-TCA)法检测肿瘤组织的顺铂耐药性，ATP-TCA试剂盒(购自上海海创生物科技公司)包括完全培养液、肿瘤组织消化酶、ATP抽提剂、荧光素-荧光素酶、稀释缓冲液、ATP标准液等。选用100%血浆峰值浓度(100%PPC)的顺铂(山东齐鲁制药有限公司)6.3 mg/L。主要操作步骤：取手术当日留取的肿瘤标本清洗剪碎，经酶解液酶解后于检测培养基中孵育约6 h，制成肿瘤细胞悬液，检测细胞存活率。将顺铂分别按药物使用浓度(6.3 mg/L)的200%、100%、50%、25%、12.5%和6.25%的浓度进行配制。将肿瘤细胞加入含化疗药的无血清培养基中培养1周后，以ATP提取液抽提肿瘤细胞ATP，应用荧光素酶试剂检测其荧光值。

1.3 ELISA法检测血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平 根据患者对顺铂的敏感和耐药情况将其分为两组，即耐药组(11例)和敏感组(26例)，抽取两组患者静脉血，采用ELISA法检测血清IL-2、TNF-α和IFN-γ水平。ELISA试剂盒购自美国eBioscences公司。将标准品按产品说明书稀释，加入相应的反应孔中。收集样本各50 μL加入相应的反应孔中，在各反应孔中加入50 μL生物素标记的抗体反应液。移去各孔内液体，加入200 μL洗涤液清洗反应孔3次，每次5 min，移去洗涤液。随后向各孔中加入100 μL的HRP偶联抗体，置于室温孵育30 min。移去各孔内液体，加入洗涤液清洗反应孔4次，每次5 min，移去洗涤液。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色液100 μL，避光37 ℃孵育15 min。取出反应板，加入50 μL终止液终止显色反应，立即检测样本在波长为450 nm处的吸光度(A450)值。

1.4 实时定量PCR检测外周血单个核细胞(PBMC)和肿瘤组织中IL-10、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平 分别在耐药组和敏感组随机(对角线取样法)选取6例患者，取其静脉血样本和肿瘤组织。采用Ficoll密度梯度离心法提取血液样本PBMC，应用QiagenRNA提取试剂盒(购自美国Qiagen公司)提取PBMC总mRNA，操作步骤严格按照说明书进行。提取的细胞总mRNA经cDNA反转录试剂盒(购自美国ThermoFisher公司)进行cDNA的反转录，采用实时定量PCR检测IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平。应用荧光定量PCR试剂盒(购自日本TaKaRa公司)进行荧光PCR反应，应用iQ5实时定量PCR仪(购自美国Bio-Rad公司)进行PCR扩增反应。荧光定量实验以GAPDH为内参照，计算Ct值，采用2-ΔΔCt法相对定量各因子mRNA的表达水平。各引物序列：IL-10正向引物5’-CCC TGG GTG AGA AGC TGA AG-3’，IL-10反向引物5’-CAC TGC CTT GCT CTT ATT TTC ACA-3’；IL-2正向引物5’-ACT CAC CAG GAT GCT CAC AT-3’，IL-2反向引物5’-AGG TAA TCC ATC TGT TCA GA-3’；IL-4正向引物5’-ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG C-3’，IL-4反向引物5’-TTC CTG TCG AGC CGT TTC AG-3’；IFN-γ正向引物5’-AGT TAT ATC TTG GCT TTT CA-3’，IFN-γ反向引物5’-ACC GAA TAA TTA GTC AGC TT-3’；TNF-α正向引物5’-GCG TGT TCA TCC GTT CTC TAC-3’，TNF-α反向引物5’-TTC TGA GCA TCG TAG TTG TTG G-3’；GAPDH正向引物5’-AGG TGA AGG TCG GAG TCA ACG-3’，GAPDH反向引物5’-AGG GGT CAT TGA TGG CAA CA-3’。

1.5 流式细胞仪检测PBMC和CD4+、CD8+T淋巴细胞中IFN-γ蛋白质表达水平 收集敏感组和耐药组患者的静脉血样本，采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，将新鲜分离的PBMC以流式洗液洗涤2次后垂悬调整细胞密度为1×106/mL。分别以抗人CD3的FITC荧光染料抗体(anti-hCD3-FITC抗体)和抗人CD8的多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)荧光染料抗体(anti-hCD8-PerCP抗体)标记PBMC表面的CD3和CD8分子，于4 ℃孵育40 min后以流式洗液洗涤3次。用细胞透膜液处理细胞后，以抗人IFN-γ的藻红蛋白(PE)荧光染料抗体(anti-hIFN-γ-PE抗体)标记细胞产生的IFN-γ，于4 ℃孵育40 min后以流式洗液洗涤3次。用500 μL流式洗液将各组细胞垂悬后，应用流式细胞仪检测PBMC和CD4+、CD8+T淋巴细胞中IFN-γ蛋白质表达水平。

2 结 果

2.1 两组患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ水平 耐药组血清IL-2和IFN-γ水平均显著低于敏感组(P值均<0.05)，两组间血清TNF-α水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别NIL-2TNF-αIFN-γ耐药112.934±0.82510.590±0.6475.231±0.905敏感26 3.551±0.745①10.800±1.059 6.685±1.380①

与耐药组比较：①P<0.05

2.2 两组患者肿瘤组织和PBMC中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平 敏感组肿瘤组织中TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平均显著高于耐药组(P值均<0.05)，两组间IL-2、IL-4、IL-10的mRNA表达水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)；敏感组PBMC中IFN-γ的mRNA表达水平显著高于耐药组(P<0.05)，IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的mRNA表达水平较耐药组有升高的趋势，但差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

2.4 两组患者PBMC和CD4+、CD8+T淋巴细胞中IFN-γ蛋白质表达水平 两组PBMC中IFN-γ蛋白质表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)，敏感组CD4+和CD8+T淋巴细胞中的IFN-γ蛋白质表达水平均显著高于耐药组(P值分别<0.01、0.05)。见表3。

组别肿瘤组织IL-2IL-4IL-10TNF-αIFN-γPBMCIL-2IL-4IL-10TNF-αIFN-γ耐药3.082±2.5882.188±0.8522.211±0.1310.580±0.2580.419±0.1561.463±0.8983.301±1.7480.576±0.2332.801±2.6241.266±1.239敏感2.730±1.0632.927±1.4431.569±0.4273.701±1.427①1.220±0.220①2.016±1.5145.050±4.6040.813±0.6043.632±3.6392.998±1.331①

与耐药组比较：①P<0.05

组别NPBMCCD4+T淋巴细胞CD8+T淋巴细胞耐药1122.535±2.89027.643±5.67210.813±0.953敏感2626.878±3.87434.867±4.629②13.787±0.925①

与耐药组比较：①P<0.01，②P<0.05

3 讨 论

目前，肿瘤细胞减灭术联合铂类药物化疗是公认的卵巢上皮性恶性肿瘤标准化治疗方案。顺铂作为一线化疗药物被广泛应用于临床，对各种实体肿瘤均有明显的治疗效果[15]。Tomao等[16]研究发现，顺铂可抑制包括DNA复制和RNA转录在内的众多细胞代谢过程，进而诱导细胞凋亡。此外，顺铂还能诱导细胞凋亡受体5(DR5)等细胞凋亡信号，促进肿瘤细胞的死亡[16-17]。然而，肿瘤细胞可对铂类药物产生耐受，严重影响化疗效果，导致肿瘤复发[15,18]。因此，明确铂类药物的耐药机制对提高卵巢癌的化疗效果具有重要意义。本研究对卵巢癌患者顺铂耐药与免疫细胞因子水平的相关性进行分析，检测顺铂对机体淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞功能的影响。

本研究结果显示，顺铂敏感组的肿瘤组织、血清和PBMC中IFN-γ水平均显著高于顺铂耐药组，表明顺铂耐药组患者T淋巴细胞IFN-γ分泌功能显著低于顺铂敏感组，提示患者对顺铂药物的敏感性可能与T淋巴细胞免疫应答状态相关。IFN-γ是重要的抗肿瘤细胞因子。近期研究[14-15]发现，肿瘤组织成纤维细胞分泌的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸可通过协同运输的方式介导顺铂从肿瘤细胞内向细胞外运输，从而减少顺铂在肿瘤细胞中的积累，降低其敏感性；但另一方面，肿瘤间质CD8+T淋巴细胞可通过分泌IFN-γ减少成纤维细胞半胱氨酸和GSH代谢，对顺铂向细胞外转运产生抑制作用。本研究结果显示，敏感组CD4+和CD8+T淋巴细胞中的IFN-γ水平均显著高于耐药组，提示IFN-γ水平升高可能在顺铂耐药形成过程中发挥重要作用。

综上所述，顺铂药物耐药性可能与CD4+和CD8+T淋巴细胞的免疫应答状态相关，血清、PBMC和肿瘤组织中IFN-γ水平升高可能对维持卵巢上皮性恶性肿瘤患者顺铂药物敏感性具有重要意义。