ALK融合基因阳性非小细胞肺癌靶向治疗的研究进展

刘琳瑞，王志强

(1.牡丹江医学院;2.牡丹江医学院附属红旗医院肿瘤内科，黑龙江 牡丹江 157011)

肺癌是全球最常见及死亡率最高的恶性肿瘤，据统计，2015年我国肺癌发病例数为73.33万例，其中男性和女性分别占50.93万例和22.40万例，死亡例数达到61.02万例[1]。肺癌按病理类型分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，其中以NSCLC最多见，占肺癌的85%,多数NSCLC发现时已进展至晚期，5年生存率约为15%。近年来，随着诊疗模式的转变，精准医学成为肿瘤治疗的热点，越来越多的基因靶点如EGFR、KRAS、ALK、BRAF、ROS被发现，靶向药物如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、克唑替尼、塞瑞替尼、奥希替尼等相继被批准用于NSCLC的治疗，本文将针对ALK在NSCLC靶向治疗的研究进展及耐药机制作一综述。

1 ALK与非小细胞肺癌

间变性淋巴瘤激酶(naplastic lymphoma kinase，ALK)被认为是间变性大细胞淋巴瘤(large-cell lymphoma，ALCL)的融合基因，是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于胰岛素受体超家族。约3%～7%的NSCLC患者可出现ALK重排，主要见于腺癌亚型，并与KRAS和EGFR突变相互排斥。2007年，Soda等人在一组NSCLC患者中发现了棘皮动物微管相关蛋白样4(Echinoderm microtubule-associated protein-4，EML4)-ALK融合基因，系2号染色体短臂中存在倒位所致。目前已发现多种ALK融合基因，但以EML4-ALK最常见[2]。EML4-ALK形成二聚体引起构象改变，通过自身磷酸化，活化多个细胞内信号通路。JAK-STAT、MAPK/ERK、PLCγ和PI3K-AKT途径是四个关键信号通路，是细胞生长、增殖和凋亡/细胞存活的调节因子，它们的调节失控是导致肿瘤发生的重要因素[2]。人肺癌细胞株H2228和H3122呈EML4-ALK阳性(尽管它们携带不同的变异)，并用于分析ALK信号传导，两种细胞系中均观察到磷酸化AKT、ERK和STAT3水平的升高，但ALK抑制对这些信号分子的激活状态有不同的影响。这表明ALK抑制剂对下游信号传导的影响取决于融合蛋白的性质。EML4-ALK融合基因多见于年轻、少吸烟或不吸烟的NSCLC患者。

2 ALK融合基因检测

ALK融合基因的检测方法包括荧光原位杂交法(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)、下一代测序(Next generation sequencing，NGS)、逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)。FISH是检测ALK重排的金标准，也是验证其他ALK检测方法的手段之一[3]。但FISH的检测成本及对检测设备、检测人员技术要求较高限制其应用。相较于FISH，IHC检测流程简易、价格低廉，已作为一种有效的筛查手段。RT-PCR是通过预先设计好的引物对样本的RNA进行逆转录来检测融合突变，简便可行，但需要高质量的RNA样本，且该方法容易突出已知的融合，基于3′/5′端表达不平衡，易导致误诊，可能无法检测到新的变异和融合伴侣[4]。目前已有证明NGS检测基因扩增、基因重排是可行的，可检测已知和新的ALK融合基因，为FISH检测提供准确、有效的替代方法，以指导NSCLC诊断和治疗。

3 靶向治疗

3.1 第一代ALK抑制剂克唑替尼(Crizotinib) 2011年，也就是Soda等人发现ALK重排作为NSCLC中潜在的致癌驱动因子后仅4年，crizotinib就被FDA批准用于治疗ALK阳性的晚期NSCLC。crizotinib是一种口服小分子ATP竞争性ALK抑制剂，最初用作MET TKI，被发现ALK重排在NSCLC中的作用后迅速转向ALK[2]。2013年和2014年分别报告了两项随机III期临床试验，比较crizotinib与第二次化疗或一线化疗的疗效[5-6]。在第一项研究中，347名之前接受过铂类化疗方案治疗的ALK阳性肺癌患者，被随机分配接受口服crizotinib或静脉注射培美曲塞或多西紫杉醇化疗。研究表明，使用crizotinib治疗的患者无进展生存期(Progression-free survival，PFS)为7.7个月，接受化疗患者的PFS为3.0个月。同时接受crizotinib治疗的患者客观缓解率(Objective response rate，ORR)也更高(65%vs 20%)。第二项研究招募了343名未接受过晚期治疗的ALK阳性肺癌患者，被随机分配接受口服crizotinib或静脉注射铂类双药化疗(培美曲塞加顺铂或卡铂)。与第一项研究相似，接受crizotinib治疗的患者PFS有所改善(10.9个月vs 7.0个月)，ORR也更高(74% vs 45%)。两项研究均未显示两组患者的总生存期(Overall survival，OS)存在显著差异。但患者使用crizotinib治疗后更大程度地减轻了肺癌的症状，生活质量明显改善。2019年美国国家综合癌症网络(National comprehensive cancer network，NCCN)指南推荐crizotinib为ALK阳性的晚期NSCLC患者的一线治疗。

3.2 第二代ALK抑制剂(1)塞瑞替尼(Ceritinib)和阿来替尼(Alectinib)：Ceritinib和Alectinib已被证明对许多crizotinib耐药的ALK阳性NSCLC有效，包括携带L1196M守门人突变的肿瘤[7-8]。体外酶促实验表明，ceritinib抑制ALK的能力是crizotinib的20倍。在I期和II期临床试验中，ceritinib对crizotinib初治和crizotinib难治性患者均有反应，与NSCLC是否存在ALK耐药突变无关。2014年4月ceritinib被FDA批准用于治疗crizotinib治疗后进展或不耐受crizotinib治疗的ALK阳性的转移性NSCLC患者[9]。随机III期试验ASCEND-4和ASCEND-5发现，ceritinib同化疗相比，PFS明显延长(26.3个月 vs 8.3个月)，且达到了更好的肿瘤缓解率[10]。根据ASCEND-4试验的结果，ceritinib于2017年5月被FDA批准用于一线NSCLC治疗。第二代ALK抑制剂alectinib优于crizotinib和ceritinib，主要原因是它可以较大剂量的透过血脑屏障。大脑是接受crizotinib治疗的患者的常见复发部位，而alectinib是伴有中枢神经系统(Central nervous system，CNS)转移患者的最佳选择。一项ALEX(III期，NCT02075840)研究比较了303例未经治疗的晚期ALK阳性NSCLC患者，分别口服alectinib(600mg/次，2次/d)和crizotinib(250mg/次，2次/d)，结果显示alectinib疗效明显优于crizotinib，两组12个月无事件生存率为68.4% vs 48%，alectinib组中有12%的患者发生CNS进展，crizotinib组为45%(P<0.001)，3至5级不良事件的发生率也较低(50% vs 41%)[11]。基于患者良好的预后，alectinib于2015年12月获得FDA批准，用于治疗疾病进展或对crizotinib不耐受的转移性ALK阳性NSCLC。2017年11月，alectinib被批准作为ALK阳性NSCLC患者的一线治疗，推荐剂量为600mg/次，2次/d[12]。而2019年NCCN指南推荐其为一线治疗的首选药物。(2)布吉替尼(Brigatinib)：Brigatinib是一种抑制ALK重排的口服型酪氨酸激酶抑制剂，对ALK的抑制作用是crizotinib的12倍。一项关于brigatinib的II期临床试验(ALTA)中，根据用药方案不同分为以下两组：A组(90mg/d)，B组(90mg/d共7d+180mg/d)，独立审查委员会(Independent review committee，IRC)评估了A、B两组的ORR为分别为45%和54%，脑转移可测量者的颅内缓解率为42%和67%，与A组相比，B组方案治疗效果更佳[13]。基于这一实验2017年4月brigatinib被FDA批准作为ALK阳性的NSCLC的二线治疗。最近的一项III期实验比较了brigatinib与crizotinib治疗ALK阳性转移性NSCLC患者的疗效，结果显示brigatinib的PFS高于crizotinib(69% vs 43%)，颅内缓解率也显著高于crizotinib(78% vs 29%)[14]。基于此2019年NCCN指南推荐brigatinib作为ALK阳性NSCLC患者的一线治疗。

3.3 第三代ALK抑制剂劳拉替尼(Lorlatinib)Lorlatinib是一种高选择性ALK/ROS1抑制剂。其克服了G1202R突变，在Ba/F3细胞中对ALK的抑制作用强于brigatinib[15]。一项I/Ⅱ期临床试验(NCT01970865)通过测定脑脊液与血浆的浓度比发现lorlatinib对血脑屏障有较强的穿透能力，因此对脑转移患者有强大的颅内治疗活性[16]。此外，lorlatinib可能使NCSLC对crizotinib重新敏感。在Shaw等人的一项研究中，lorlatinib用于治疗一例crizotinib耐药的C1156Y ALK阳性NSCLC患者，在lorlatinib复发后，活组织检查显示肿瘤除C1166Y突变外，还存在ALK L1198F突变[17]。即使如此，L1198F突变通过增强crizotinib与ALK的结合，可使其再次有效。另一项正在进行的Ⅲ期临床实验(NCT03052608)用lorlatinib和crizotinib治疗进行对比，探索对ALK阳性NSCLC患者的安全性和有效性，期待研究结果的报道[18]。2018年11月FDA批准lorlatinib治疗既往接受其他ALK抑制剂治疗后疾病进展的晚期ALK阳性NSCLC患者。

4 ALK抑制剂耐药机制

4.1 crizotinib耐药机制治疗1～2年内出现快速耐药是限制crizotinib使用的主要因素。ALK激酶区突变是导致肿瘤对crizotinib耐药的机制之一，突变类型包括G1269A、F1174C、L1152R、S1206Y、I152Tins、V1180L、C1156Y、G1202R、G1269S、L1196M。其中以L1196M最常见，G1269A次之[7]。L1196M又称为“守门人”突变，它控制小分子ALK抑制剂进入催化位点内的疏水口袋。已发现多个通过削弱crizotinib与激酶结构域ATP结合位点的亲和力而产生的耐药性突变，包括G1269A、S1206Y、G1202R和V1180L。crizotinib耐药的机制还包括ALK基因拷贝数扩增、信号传导途径旁路激活、肿瘤的异质性。研究报道克唑替尼耐药的肿瘤中，可观察到在EGFR中的L858R激活突变导致与ALK无关的下游通路如MAPK或PI3K-AKT的异常激活[19]。EGFR以外的其他HER家族成员包括HER2和HER3的激活增加，也可能介导对crizotinib的继发性耐药。此外，IGF1R信号传导上调已被确定为一个重要的旁路通道，在临床前模型中阻断IGF1R活性可使crizotinib耐药细胞对ALK的抑制重新敏感。KIT的扩增也是crizotinib耐药的潜在机制。这些耐药机制的各种组合可在部分患者中被同时被检测出来。

4.2 Ceritinib和Alectinib耐药机制与Ceritinib有关的耐药突变包括G1202R、F1174L、C1156Y、1151Tins及L1152R。在Gainor等人的一项研究中[15]，对103例使用第一代和第二代ALK抑制剂进展的ALK阳性患者进行重复活检分析，发现G1202R是接受第二代ALK抑制剂患者中最常见的耐药突变。G1202位于ALK激酶结构域的溶剂暴露区，由于较大的带电侧链，在该位置取代精氨酸可能导致ALK抑制剂的空间位阻。1171和V1180L是与alectinib有关的两个耐药突变。旁路途经的激活也是第二代ALK抑制剂耐药的机制之一，在使用ceritinib和alectinib的患者体内均发现了MET扩增。与第二代ALK抑制剂耐药有关的其他通路包括SRC、MAPK和PI3K，但需要进一步研究以阐明它们的机制。另外两个不涉及旁路通路激活的潜在耐药机制是P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)过度表达和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。P-gp的过度表达对crizotinib和ceritinib具有耐药性，而对alectinib没有耐药性。在一项研究中，上调神经调节蛋白1(Neuregulin，NRG1)可通过激活EGFR家族通路(NRG1-HER3-EGFR轴)，使NCI-H3122细胞对ceritinib、alectinib和brigatinib产生耐药性[20]。

4.3 Brigatinib耐药机制对于上述讨论的几乎所有ALK突变，brigatinib在体外均表现出较高的抑制性和选择性，其克服了对其他第一和第二代ALK抑制剂的耐药性。然而，在brigatinib进展的患者中发现了难治性G1202R耐药突变，其对ALK的抑制作用较弱[15,21]。但与crizotinib或任何其他第二代ALK抑制剂相比，brigatinib仍具有更高的活性。

5 未来发展方向

5.1 ALK抑制剂序贯治疗改善ALK融合基因阳性NSCLC患者预后的一种策略是根据患者的ALK突变谱，及目前关于这些突变对不同ALK抑制剂耐药性或敏感性的认识，采用第一代、第二代和第三代ALK抑制剂的不同组合进行序贯治疗。一项招募了73名ALK阳性NSCLC患者的回顾性研究发现，使用crizotinib和ceritinib进行序贯治疗的中位PFS为17.4个月，而在使用ceritinib之前，单独使用crizotinib的中位无进展生存期(Median progression-free survival，mPFS)仅为8.2个月，该研究结果显示了序贯治疗的可行性[22]。当然，我们期待更多的前瞻性研究结果为患者提供更有效的治疗方案。

5.2 与其他药物联合治疗目前正在研究各种形式的联合治疗，以诱导对ALK抑制剂耐药患者产生持久的反应。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)的异常表达与肺癌的发生发展密切相关，研究发现EGFR激活至少有三种机制可以促进肺癌靶向癌激酶融合治疗的耐药，包括针对ALK的机制[23]。这表明与单用ALK抑制剂相比，ALK和EGFR的靶向联合治疗这种特异性耐药更有效。如前所述，当治疗EGFR通路过度活化的ceritinib和alectinib耐药细胞时，ceritinib或alectinib联合EGFR抑制剂阿法替尼更有效[20]。热休克蛋白90(Heat shock protein90，HSP90)是一种重要的分子伴侣，在蛋白质的正确折叠和稳定中发挥重要作用。Gnestespib是HSP90抑制剂，与ALK抑制剂联合显示出了良好的抗肿瘤效果。ganetespib克服了多种形式的crizotinib耐药，包括常见的ALK继发性突变。HSP90抑制剂的常见毒性反应有腹泻、恶心、呕吐、乏力、夜盲症和视力减退，严重时需停药。因此，降低联合治疗的毒性反应是未来临床试验中需要解决的关键问题。免疫治疗也是目前研究的热点，正在进行的一项临床实验(NCT02584634)通过比较avelumab与crizotinib或lorlatinib的联合探索晚期NSCLC患者的治疗效果[24]。另一项关于纳武单抗(Nivolumab)联合crizotinib作为NSCLC患者的一线治疗的I/II临床试验(CheckMate370)也正在开展[25]。由于ALK融合基因的检测方法和ALK抑制剂的成本较高，无论是序贯治疗或是与其他药物联合，治疗的目标都是提高患者质量调整寿命年(Quality-adjusted life years，QALYs)，降低治疗成本。

6 小结

在NSCLC中发现ALK融合基因后，靶向治疗药物应运而生，同时，用于指导治疗的ALK检测也迅速发展，目前广泛使用的检测方法有IHC、FISH、RT-PCR和NGS。使用ALK抑制剂治疗使患者的PFS延长，症状严重程度降低，与化疗相比为患者提供了更高的生活质量。然而，耐药成为一个主要的限制因素。ALK抑制剂的序贯治疗及ALK与其他抑制剂的联合也不失为一种选择。但crizotinib等ALK抑制剂价格昂贵，且联合治疗加重了毒性反应。因此，加深对耐药机制的研究，加快对新型抗肿瘤药物的研发及探索更多形式的治疗是改善NSCLC患者预后的关键所在。