不同烟叶醇化仓库的仓间空气霉菌组成差异分析

姜振锟 刘景川 陈善义 李菁菁 何伟 张增基 沈禄恒

摘 要：为明确片烟醇化仓库仓间空气中含有的霉菌种类和组成，以龙岩烟草工业有限责任公司东肖烟叶库3个仓库为研究对象，采用空气微生物采样器进行浮游霉菌采样，所得的霉菌平板经28℃下培养4d后计数，挑取菌落并进行ITS测序，分析不同烟叶醇化仓库的仓间空气浮游霉菌的组成差异。结果表明，相对湿度大的仓库，其仓间空气中含有的霉菌数量多;3个仓库仓间空气中收集获得的霉菌共有15个种，含量占比在25%以上的霉菌为极细枝孢、枝状枝孢菌和桔青霉;极细枝孢为4号库的优势霉菌，而枝状枝孢菌为9号库、13号库的优势霉菌。

关键词：霉菌;微生物区系;片烟;仓储养护

中图分类号 S572文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）22-0040-02

在卷烟生产加工过程中，复烤后的片烟仓储醇化是一个重要环节。片烟自然醇化周期较长，通常为12～30个月[1-3]。空气中存在着多种霉菌，片烟在仓储过程易沾染霉菌孢子，由于烟叶中含有霉菌生长所需的蛋白质、还原糖等多种营养物质，再加上烟叶本身吸湿性强，一旦条件适宜，易发生霉变[4]，严重影响烟叶的使用价值。有关片烟霉变微生物的区系研究，目前主要集中在片烟本身含有的霉菌，而对于仓储醇化过程中仓间空气霉菌的研究甚少。为此，本研究以龙岩烟草工业有限责任公司烟叶仓库为试验对象，利用空气微生物采样器采集仓库仓间空气霉菌孢子，分析不同仓库空气霉菌的组成差异，旨在为片烟霉变的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 氯硝胺18%甘油（DG18）琼脂培养基：购于广东环凯微生物科技有限公司（货号021115），按厂家说明书配制，121℃下灭菌15min后，冷却至约65℃时，向培养基中加入硫酸链霉素（终浓度为50μg/mL）。改良马丁琼脂培养基：购于广东环凯微生物科技有限公司（货号021041），按厂家说明书配制，121℃下灭菌15min。仪器：空气微生物采样器（MAS-100NT型，Millipore公司，瑞士）、恒温恒湿培养箱（CLC-B2V-M/CLC 222-TV型，MMM Group公司，德国）。

1.2 方法 采样地点位于龙岩烟草工业有限责任公司东肖烟叶仓库4号（2001年建成，密封条件较差）、9号（2008年建成，密封条件较好）、13号（2010年建成，密封条件中等）醇化库，所选楼层均为3楼（3个仓库总楼层数均为5层）。以DG18培养基为霉菌收集培养基，利用MAS-100NT空气采样器进行仓间空气霉菌采样，采样体积为100L，每个仓库重复3次。采样时，利用手持式温湿度仪测量并记录仓间空气的温湿度。采样结束后，盖上培养皿盖，所得微生物平板带回实验室，于28℃下培养4d后，统计每个培养皿上长出的菌落数。挑取菌落形态及颜色差异较大的菌落，转移至改良马丁琼脂培养基，于28℃培养4d。重复上述传代过程，直至长出的菌落形态单一，以实现菌落的纯化。纯化好的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行ITS测序，所得序列于GenBank数据库中进行BLAST比对。用MEGA X软件[5]自带的Clustal W模块对所得霉菌ITS序列进行多重比对。然后通过MEGA X软件中的Maximum Composite Likelihood模型计算进化距离，利用Neighbor-Joining法构建系统发育树，Bootstrap重复次数设置为1000次。

2 結果与分析

2.1 不同烟叶醇化仓库的霉菌数量 由表1可知，就温度而言，采样时3个仓库空气温度差异不大。相对湿度方面，4号库最大、9号库最小、13号库居中。相应地，4号库平均的霉菌含量最大、9号库最小、13号库居中。3个仓库霉菌含量彼此之间差异显著，且4号库与其余2个仓库差异达到极显著水平。这说明仓间空气中霉菌的含量与空气相对湿度关系密切。

2.2 不同烟叶醇化仓库的霉菌组成差异 由表2～4可知，4号库仓间空气含有6种霉菌，分别为极细枝孢、Cladosporium xanthochromaticum、菌核青霉菌、拟粉红锁掷孢酵母、裂褶菌以及小孢拟盘多毛孢，其中极细枝孢为优势菌，占比为83.58%;9号库仓间空气含有5种霉菌，分别为枝状枝孢菌、短密青霉菌、裂褶菌、小孢拟盘多毛孢以及Penicillium virgatum，其中枝状枝孢菌为优势菌，占比为81.40%;13号库仓间空气含有4种霉菌，分别为枝状枝孢菌、桔青霉、顶青霉及鲜红青霉，其中枝状枝孢菌为优势菌，占比为66.67%。此外，4号、9号库共同含有的霉菌种类为裂褶菌和小孢拟盘多毛孢，9号、13号库共同含有的霉菌为枝状枝孢菌。

2.3 东肖烟叶仓库仓间空气中霉菌的系统进化树分析 由图1可知，3个仓库仓间空气分离所得菌株共有15个种。所得的15种霉菌在系统进化树上形成2大分支，其中4号库的DX4-5菌株独立形成1个大的分支，其余14种霉菌另形成1个大的分支，说明DX4-5菌株与其余14个种菌株的亲缘关系较远。

3 结论与讨论

对比3个仓库的温湿度条件和霉菌数量可以得知，仓库条件和仓间环境的湿度对仓间空气霉菌数量的影响较大。仓库条件好、湿度较低的情况下，空气中的霉菌数量明显少于仓库条件差、湿度较高的仓库。因此，控制仓库的环境湿度可有效减少空气中霉菌的数量，进而降低仓储片烟霉变的风险。ITS测序及BLAST比对结果表明，极细枝孢、枝状枝孢菌和桔青霉为相对的优势霉菌，不同仓库的仓间空气霉菌组成有所差异。下一步应开展上述优势霉菌的生物学特性及致霉条件的研究，以期为仓储片烟的霉变控制提供科学依据。

参考文献

[1]陈万年，宋纪真，范坚强，等.福建和云南烤烟烟片的最佳醇化期及适宜贮存时间[J].烟草科技，2003（7）：9-12.

[2]齐凌峰，卓思楚，宋纪真，等.不同产地片烟的最佳醇化期及适宜贮存时间研究[J].安徽农业科学，2010，38（1）：155-157.

[3]齐凌峰，卓思楚，宋纪真，等.上部烟叶在厦门的最佳醇化期及适宜贮存时间[J].湖北农业科学，2014，53（1）：106-109.

[4]李春艳，赵高岭，叶红朝，等. 河南烟叶仓储期优势霉菌的分离鉴定及防霉剂的筛选[J].烟草科技，2011（7）：64-68.

[5]Kumar S.， Stecher G.， Li M.， et al. MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J].Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）：1547-1549.

（责编：张宏民）

基金项目：福建中烟工业有限责任公司科技项目（FJZYKJJH2018011）。

作者简介：姜振锟（1994—），男，福建永定人，助理工程师，从事烟草原料研究工作。刘景川（1988—），男，福建龙岩人，助理农艺师，从事烟草原料研究工作。#共同第一作者 *通讯作者  收稿日期：2019-09-23