氮素水平对烟草幼苗生长发育及碳氮代谢关键酶活性的影响

王菲 雷波 谢伶俐 李震 许本波

摘 要：采用盆栽种植，以烟草K326为试验材料，CO（NH2）2为氮源，研究了4个氮素水平（0.1%、0.2%、0.3%和0.4%）对烟草生长发育及碳氮代谢关键酶活性的影响。结果表明，高氮对烟草幼苗的生长发育造成了一定程度的胁迫，导致植株矮小，叶片发黄;随着氮素处理水平的提高，烟碱含量下降，可溶性糖含量先下降后上升;谷氨酸合成酶活性先上升后下降，谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶呈上升的趋势，硝酸还原酶活性先降低后升高;而淀粉酶、蔗糖转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性呈上升的趨势。在高氮水平下，碳代谢活性增强，而氮代谢水平降低。相关分析表明，CO（NH2）2水平与烟碱含量呈负相关。

关键词：烤烟;碳氮代谢;硝酸还原酶;烟碱;可溶性糖

中图分类号 S565.4;Q78文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）22-0014-06

Effects of Nitrogen Levels on Seedlings Growth and Key Enzyme Activities for Carbon and Nitrogen Metabolism of Flue-cured Tobacco

Wang Fei1 et al.

（1College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China）

Abstract：In this experiment，the effects of differentnitrogen levels （0.1%，0.2%，0.3% and 0.4%） on the key enzyme activities of carbon and nitrogen metabolism of tobacco K326 was studied with potted planting based on CO（NH2）2. The results showed that high nitrogen leves inhibted tobacco plants growth and caused toyellow leaves. With the increase of nitrogen treatment level，nicotine content decreased and soluble sugar content first decreased and then increased. The activity of glutamate synthase first increased and then decreased，while that of glutamine synthase and glutamate dehydrogenase increased，and that of nitrate reductase decreased and then increased with increasing nitrogen level. The activities of amylase，sucrose invertase，sucrose synthase and sucrose phosphate synthase increased with increasing nitrogen level. All indicated high nitrogen level induced carbon metabolism，but inhited nitrogen metabolism. The correlation analysis showed that CO（NH2）2 level was negatively correlated with nicotine content.

Key words：Flue-cured tobacco;Carbon and nitrogen metabolism;Nitrate reductase;Nicotine;Soluble sugar

烟草是我国重要的经济作物之一，属于双子叶植物纲管花目茄科烟草属，烟叶的品质对烟草经济价值具有重要意义[1]。研究发现，碳、氮作为植物体内主要的两大元素，其代谢过程能够直接或间接的影响烟草中相关物质的化学组成，进而影响品质[2]。碳氮代谢作为最基本的生理代谢，能够影响矿质元素的吸收、转化、积累以及相关蛋白质的合成。碳氮代谢密切联系，共同促进植物的生长发育，碳代谢过程中所固定的碳骨架与能量（ATP和GTP）能够提供给氮代谢，而氮代谢所产生酶和蛋白又被碳代谢所需要[3]，碳氮代谢的协调程度关系到烟叶的产量的高低和品质的优劣。合适的碳氮比是氮代谢产物与碳代谢产物的集中体现，优质的烟叶应当在合适的时期由氮代谢和碳的固定和转化代谢为主转变为碳的积累代谢为主[4-5]，2个代谢之间的协调程度直接关系到优质烟叶的生产。因此，研究不同施氮水平对烟草碳氮代谢的影响具有重要的理论和实际意义[6]。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验在长江大学生命科学学院人工气候室中进行。供试烤烟品种为K326，采用土壤与基质肥以1∶1比例混匀，测得混匀后土壤氮含量为0.1%。

1.2 试验处理 将生长一致的6叶龄烟草幼苗移栽到添加不同氮素的基质中进行不同水平氮素（CO（NH2）2）处理（0.1%、0.2%、0.3%和0.4%）。20d后，随机挑选单株叶片（自下而上第3片叶）取样，取样后立即放置于-70℃环境中冻存，待测。

1.3 测定方法 分别采用提取脱色法[7]和蒽酮比色法[8]测量烟碱和可溶性还原糖含量;蔗糖转化酶活性测定采用3.5-二硝基水杨酸法[9];蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性测定采用Seger[10]和Bruskoya[11]等报道的分光光度计法;淀粉酶测定采用3.5-二硝基水杨酸法[12];硝酸还原酶（NR）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）活性测定采用Krishna[13]、Singh[13]、Nagy[14]和Mathur[15]等报道的分光光度计法;活性测定采用等报道的方法。试验数据采用Excel 2007、SPSS17.0和DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同施氮素水平对烟株生长发育的影响 由图1可知，不同施氮量处理植株20d后的表型特征差异明显。与CK相比，土壤含氮量在0.2%时，植株生长缓慢，叶面积减少，叶片颜色加深;继续提高土壤含氮量到0.3%时，植株幼小，生长受阻，叶面积继续降低，叶片四周出现黄化;当持续加大土壤含氮量到0.4%时，植株萎蔫，黄化，生长发育受到更为严重的迫害，几乎致死。高氮胁迫下的烟草幼苗生长缓慢，体积减少50%以上，叶片含水量降低，植株的生理代谢过程受到影响。可见，各氮素处理间差异显著，可用于探索高氮条件下烟草碳氮代谢之间的关系。

2.2 不同施氮素水平对烟株中烟碱和糖含量的影响 烟碱是烟草重要的生理活性物质，烟叶中的烟碱含量直接决定着烤烟的品质，是烟叶原料和卷烟产品质量控制的一个重要指标。合适的烟碱含量是实现优质低害烤烟生产的重要目标。从图2（a）可以看出，随着施氮量的增加（氮素水平从0.1%增加到0.4%），烟叶中烟碱含量呈下降的趋势。氮素水平为0.3%的时候，烟碱含量最低为0.58%;继续提高氮素水平到0.4%，烟碱无显著变化。可溶性糖是植物主要营养物质之一，其主要用于合成纤维素形成细胞壁，同时可溶性糖水合性强，可溶性糖含量的增加可以使植株渗透势下降，有助于细胞或组织的持水，减少植物体细胞或组织所受到的伤害，提高植物的抗逆能力。由图1可以看出，在高氮胁迫下，植株出现生长矮小，叶片含水量降低，同时叶片颜色加深。由图2（b）发现，随着施氮量的增加，可溶性糖含量逐渐降低，当氮素浓度达到0.3%时，可溶性糖含量最低，含量只有0.36g/110g·FW。当氮素浓度由0.3%增加到0.4%时，可溶性糖含量开始升高，但仍显著低于对照的，且叶片更容易受到机械损伤。

2.3 不同施氮量对糖代谢相关酶活性的影响 淀粉酶是碳水化合物中主要的酶类，可将叶绿体中积累的淀粉转化为单糖，因而直接关系到植株体内淀粉的积累量，从而影响光合碳代谢强度。由图3（a）可知，随着施氮量的增加，淀粉酶活性整体呈现先下降后上升的趋势;氮素水平由0.1%增加到0.3%，淀粉酶活性有一定程度的下降，随着氮素浓度进一步持续升高，淀粉酶活性又呈现上升的趋势。这在一定程度上说明，高氮胁迫下，碳代谢强度加大，淀粉酶活性升高。蔗糖转化酶催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖，包括细胞壁蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶和细胞质蔗糖转化酶3类。糖类不仅作为一种能源物质，同时也是重要的信号分子。越来越多的研究表明，植物体内的蔗糖转化酶能够对碳水化合物的代谢和分配进行调控，从而改变植物的发育模式[16]。由图3（b）可知，不同氮素处理20d后，随着施氮量的增加，蔗糖转化酶活性逐渐上升，在氮含量为0.2%、0.3%，转化酶活性无显著差异，但整体来看，3个处理组与对照组相比，其转化酶活性显著提高。

蔗糖合成酶可逆的将蔗糖分解为鸟苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖;而蔗糖磷酸合成酶可催化UDPG与果糖6-磷酸结合形成磷酸蔗糖。蔗糖作为植物代谢，发育和生长中的重要物质，不仅能在植株生长中提供能量和碳骨架，而且能够提高植株的抗逆性[16]。蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶都参与蔗糖的合成，其活性的高低直接体现了植物体蔗糖合成的能力强弱。由图3（c）和3（d）可知，随着施氮量的提高，蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶的活性随之上升;当氮含量在0.2%、0.3%时，2种酶活性没有显著性差异，但3个处理组与对照组之间，2种酶活性与未施氮的处理组之间具有极显著差异。

2.4 不同施氮量对氮代谢相关酶活性的影响 GS是处于氮代谢中间的关键酶，主要催化NH4+离子与氨基酸合成谷氨酰胺，进而参与光呼吸氨、还原氨、循环氨的再同化等代谢过程，GS活性的增强，使植株对氮素的吸收能力增强，当氮素含量过高时，植株自身受到胁迫作用大，氮素转化率随之降低，活性下降。从图4（a）可以看出，随着施氮量的提高，GS活性随之上升，但当施氮量达到0.4%时，GS活性反而降低。GOGAT（GOGAT）主要催化谷氨酰胺与a-酮戊二酸形成谷氨酸。在高等植物体中铵离子的同化离不开GOGAT的协同催化，其与GS组成的GS/GOGAT循环系统，在植物固定氮素过程中起着关键性作用[16]。从图4（b）可以看出，随着施氮量的提高，GOGAT的活性随之显著性上升。在后3组氮素处理中GOGAT的活性没有显著性差异。结果表明，在高氮胁迫下，植物体吸收氮素后，其氮素同化作用加强。植物体内的氮循环中常由GS和GOGAT协同作用，组成GS/GOGAT循环，将NH4+离子转化为氨基酸，该途径为高等植物NH4+离子同化的主要途径。同时，GDH可催化a-酮戊二酸与氨生成谷氨酸，该催化过程为可逆反应。GDH有双重功能，当外部环境无机氮源水平较高的时候，GDH行使铵同化作用;当植物缺少有机碳源时，GDH主要促进谷氨酸分解，并为三羧酸循环提供碳骨架。因此，GDH一定程度上可以促進碳氮代谢的平衡，对维持植物体内碳氮平衡起着关键作用[16]。由图4（d）可知，随着施氮量的增加，GDH的活性随之上升，有可能是氮素水平较高，需要高的GDH活性行使铵同化功能。

植物主要从土壤中吸收铵态氮和硝态氮，其中硝酸盐是高等植物的主要氮来源。NR将硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐进入叶绿体或质体中，最终被降解为铵。NR是植物氮同化的关键酶，在初级氮同化中的控制中起着关键性的作用[16]。由图4（c）可知，随着施氮量的增加，含氮量在0.2%、0.3%时，NR活性显著性降低，当施氮量达到0.4%时，NR活性却反而上升。

2.5 可溶性糖含量与烟碱含量的相关性分析 对不同氮素水平与烟碱含量和可溶性糖含量进行相关性分析可知（图5），烟碱含量与氮素水平呈现显著负相关，烟碱作为氮代谢途径中的关键产物，随着施氮量的增加，烟碱含量随之降低。而氮素水平与可溶性糖含量相关较低。说明在高氮胁迫下，高浓度的氮素浓度，使氮代谢和碳代谢过程都受到一定程度的抑制，但从氮代谢和碳代谢相关酶活性的变化中可以看出，氮代谢初级酶NR活力随着氮素浓度的升高而降低，虽然在氮素同化的相关酶活性GDH、GS、谷氨酸合成酶活性升高，但氮代谢初级酶活力限制了氮同化的能力，导致氮代谢能力降低。而碳代谢相关酶蔗糖合成酶、淀粉酶、蔗糖转化酶、蔗糖磷酸合成酶活力随氮素浓度的提高而随之上升。该结果说明，在6叶龄烟草植株中，施用高浓度的氮素浓度会将碳代谢能力提高，氮代谢能力降低，叶片颜色浓绿，植株矮小，碳氮代谢之间的平衡被破坏，使得烟草植株生长达不到最佳状态。植物对NH4+的浓度忍耐性较低，高浓度NH4+影响根系和幼苗的生长本试验中，本试验中利用CO（NH2）2调控氮素水平，可能也是得到烟碱含量与氮素水平呈现负相关结论的原因之一。

3 讨论

烟草的生长与施氮量具有非常密切的关系，碳代谢与氮代谢作为植物体内的基本的代谢，是植物体积累养分的过程。同时氮素是植物的生命元素，不同水平的施氮量对植株的生长，碳氮代谢之间的平衡与协调，植株发育，与物质的积累具有重要影响。烟叶作为烟草植株中主要收获的产品，其品质的高低也与施肥量有关。

植物根系对NH4+的吸收为被动吸收，但植物根系吸收NH4+时在细胞膜外脱H+或分泌H+，因而造成土壤酸化，危害植物的生长发育。本试验结果表明，在高氮水平下，继续进一步加大施氮量，对植株的生理生长具有迫害作用，植株叶片颜色逐渐加深，叶片数减少，叶片发黄甚至萎蔫致死，当氮素浓度达到0.4%时，植株生长受到的胁迫更大，几乎致死。同时，随着氮素浓度的增加，NR活性降低。有研究指出，NR在一定程度上代表植株的氮代谢强度，而烟碱作为氮代谢的产物，随着含氮量增加，烟碱含量随之降低。这在一定程度上说明，过高的含氮量对烟草氮代谢具有一定的胁迫作用，氮代谢减慢，植株生长受到抑制。

碳代谢是烟草植株生长和品质形成的基本代谢之一，对烟草植株中重要化合物的组分，含量和比例具有重要影响[17]。蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖转化酶、淀粉酶是碳代谢中非常重要的酶，其活性可作为衡量碳代谢强度的重要指标[18]。本试验中，随着氮素浓度的升高，蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖转化酶、淀粉酶活性升高。蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖转化酶在蔗糖代谢和积累中起着重要作用，蔗糖磷酸合成酶主要介导的反应为催化叶片中蔗糖的形成[19]，而蔗糖合成酶介导蔗糖的合成与分解，转化酶作为一种水解酶，可催化蔗糖形成单糖[20]。在高氮胁迫下，碳代谢强度增强。氮肥的供应量与碳代谢相关酶活性密切相关，过高或过低的施氮量对植株的生长均产生不利影响[21]。

氮代谢在烟草生长过程中起着重要作用，包括有机物的合成和转化[22]，烟草的氮代谢过程属于多种酶参与的复杂反应，这些酶在氮代谢过程起着不可或缺的作用。NR、谷氨酸合成酶、GS、GDH等都是氮代谢中关键酶，本次试验中，NR随着氮素浓度的上升活性随之降低，而谷氨酸合成酶、GS、GDH随着氮素浓度的升高，其活性随之升高。NR作为硝酸同化过程中第1个关键酶，对植物的生长，呼吸及光合作用有着极其大的影响，NR活性在一定程度上可反映烟草的氮代谢水平[23]。有研究表明，烤烟的NR活性和GS活性均随着生育进程的推进而增加，60d达到最大值然后下降。本试验中，高氮浓度处理下，随着氮素浓度的升高，NR活性的降低，表明高氮胁迫下，烟草植株的生长受到胁迫，初始氮代谢强度降低。烟草植株的氨同化过程是通过GS/GOGAT循环[2]进行的，随着氮素浓度的提高，两种酶活性升高，说明在高氮胁迫下，植株的氮同化的效率提高。而对于GDH来讲，随着在GDH的催化下，谷氨酸脱氨生成2-酮戊二酸。2-酮戊二酸为植物体内主要的氨同化途径GS/GOGA循环提供底物，为氨同化提供碳骨架，同时它还是三羧酸循环过程中重要的一种中间物，和碳代谢的下游一种非常重要的有机酸，GDH是连接C、N代谢的关键点[24]。在本试验中，随着氮素浓度的提高，GDH的活性随之上升。高氮情况下，GDH主要行使碳代谢相关酶功能还是氮代谢相关酶功能没有准确的研究结论。但有研究表明，GDH只有在氨浓度高时才起到同化作用，GDH在解除氨毒过程中起到主要作用[25]。同时，GDH作为碳氮代谢中的关键酶，起到的谷氨酸脱氨作用能够使得氨进入GS/GOGA循环，对整个循环过程起到辅助作用。

在高氮水平下，含碳化合物可溶性糖含量，含氮化合物烟碱的含量随着施氮量的增加，呈现先下降后上升的趋势，但是整体呈现下降的趋势，表明高氮水平抑制烟株的生长，减少了糖类的积累。烟碱的主要形成部位在根部，胁迫作用下，对植物根部的损害作用加大，导致烟碱的合成受阻，烟碱含量降低。从整体来看，碳氮代谢都因施用过量的氮肥而受到影响，在此过程中造成碳代谢过程提前，氮代谢过程延缓，碳氮代谢平衡受到破坏，不利于植株生长。

4 结论

通过研究4个不同氮浓度下，碳氮代谢中关键酶活性及物质积累，可以得出以下结论：（1）在高氮水平下，随着施氮量的增加，对植株的胁迫作用加大，主要表现在：植株矮小，叶片颜色加深，生长缓慢，氮素浓度在0.4%植株叶片邊缘发黄甚至凋零;（2）随着施氮量的增加，碳代谢相关酶，蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖转化酶、淀粉酶活性增加，说明在高氮处理下碳代谢加强;（3）随着施氮量的增加，氮代谢中主要酶NR活性随着施氮量的增加，整体呈现先下降后上升的趋势，但酶活性整体呈下降的趋势，表明在高氮抑制氮代谢，抑制植株的生长;（4）高浓度的氮含量对植物烟碱的形成有抑制作用，影响根部合成烟碱。同时，高浓度的氮含量使得烟草植株可溶性糖含量降低，糖类作为植物中直接供能物质，其含量的降低直接反映了高氮处理下植株矮小，生长受阻的表型。由此可知，适宜的氮含量对烟草植株生长有着极其重要的影响。

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（責编：张宏民）