超声波辅助提取羊奶果提取物中总黄酮及其抗氧化性研究

李扬 邵永明

摘 要：以羊奶果为原料，采用超声波辅助法，利用响应面分析法优化羊奶果中总黄酮的提取工艺及其提取物体外抗氧化效果，结果表明，最佳工艺条件为：超声乙醇提取温度40.0℃、液料比5∶1、超声波辅助提取时间30min，超声波辅助提取功率167.0W，在此条件下，羊奶果中总黄酮的提取率可达到25.0046g·kg-1。在不同油脂中添加梯度浓度的总黄酮提取物，对DPPH自由基的清除，羊奶果提取物均具有较强抗氧化性。

关键词：羊奶果;总黄酮;超声辅助乙醇法;响应面

中图分类号 TS411文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）22-0019-04

Ultrasonic Assisted Extraction of Total Flavonoids from Sheep Milk Fruit Extract and its Antioxidant Activity

Li Yang1 et al.

（1Jilin Institute of Agricultural Science and Technology，Jilin 132001，China）

Abstract：In the ultrasonic assisted extraction of total flavonoids from sheep milk fruit，the ultrasonic extraction temperature was 40.0 °C，the liquid-to-liquid ratio was 5：1，the ultrasonic assisted extraction time was 30 min， and the ultrasonic assisted extraction power was 167.0 W. The reliability of the condition was continuously carried out in three parallel experiments. The total flavonoids in goat milk were extracted by the above optimal conditions，and the average extraction amount of total flavonoids in goat milk was 25.0046g·kg-1. Theoretically，goat milk was obtained. The extraction amount of total flavonoids was 25.7581 g·kg-1，and the relative error between the two was 0.29%. The antioxidant effect of total flavonoids extract from sheep milk fruit in vitro was studied. The antioxidant effect of total flavonoids extract with gradient concentration in different oils and oils was observed，and the scavenging effect on DPPH free radical showed that sheep milk fruit extract had strong antioxidant activity.

Key words：Sheep milk fruit;Total flavonoids;Ultrasound-assisted ethanol method;Response surface

羊奶果（Elueagnus Confetta Koxh），又名牛虱子果、羊山咪树、长匐茎胡颓子[1]，属胡颓子科、胡颓子属、木本多年生常绿植物。其形态呈椭圆形，颜色由绿色变到红色，由生至熟，成熟的颜色呈现鲜红色，体积略大于鸽卵。羊奶果本身是一种营养价值非常高的浆果类的植物，成熟羊奶果的含水量在90%以上，粗蛋白约占2.5%，总糖量含量约占5.2%（其中还原糖占99.2%），粗脂肪含量约占2.9%，总酸量含量约占1.46%;总黄酮含量约占0.45%，新鲜羊奶果每100g中含钙量大约20.3mg，含类胡萝卜素量大约3.16mg，羊奶果味道本身带酸、带涩，并含有大量的溶解酶，所以，饭后食用羊奶果，对食物中的含有的蛋白质有很好的消化作用。羊奶果原产热带地区（南亚、西亚等），现在分布广泛，早产量产，在我国的云南、贵州、广西西部等地区，主要以野生为主[2]。在广西山圩农场周围人工试种获得试验成功，但受深加工条件的限制至今还未能够量产[2]。因此，开发和探究羊奶果中各微量元素含量工艺及其复合产品深加工，对发展羊奶果生产和应用具有非常重要的现实的意义3]。总黄酮又叫黄碱素[4]、黄酮体、类黄酮，其主要以化合物的形式，广泛存在于自然界的植物中，属于次生代谢物[8]。羊奶果中总黄酮是一类同分异构体、氢化物、还原产物等[5]的黄色色素。在植物中，主要與糖类结合，形成糖苷或者碳水化合物，有些也以游离形式存在。它主要的功效有：抗衰老、抗疲劳、抗癌、抗肿瘤、降血脂、降血清胆固醇、增加机体免疫等作用。

本文采用超声波辅助乙醇提取法提取羊奶果中的总黄酮，利用响应面分析法优化羊奶果中总黄酮提取试验条件[14]，探究最佳的工艺条件，为羊奶果中总黄酮的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂 羊奶果、芦丁标准品、乙醇、无水氯化钙、柠檬酸钠。

1.2 仪器与设备 UV-2600 紫外可见分光光度计、H2050R-1离心机、超声波清洗机。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮的定性检验方法 铁离子反应，若提取液呈墨绿色，则表明有黄酮存在。

1.3.2 总黄酮的定量分析 （1）标准曲线的建立：用紫外可见分光光度计测定其吸光度。记录数据，并以芦丁质量浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线。

标准曲线方程：y=11.314x-0.0004，R2=0.9888，芦丁标准溶液在0.02～0.10mg·mL-1范围内线性良好。

（2）准确度：试验数据所得的相对标准偏差为1.12%<2.0%。

（3）线性：试验线性即为标准曲线，试验结果显示，y=11.314x-0.0004，R2=0.9888，线性良好。

（4）羊奶果中总黄酮化合物得率的计算：取各自条件下所提取得到的羊奶果总黄酮样液，测定其吸光度，按以下公式计算总黄酮的得率：

得率（%）=×100CV/M×100 （1）

上式中：C为提取液浓度g/mL，V为提取液原始体积mL，M为所取羊奶果粉质量g。

1.3.3 体外抗氧化效果测试 （1）DPPH自由基清除能力测定：

DPPH或 ABTS自由基清除率（%）=[（A0-（AX-AX0））/A0]×100 （2）

1.3.4 油脂抗氧化性研究 在油脂中分别加入不同浓度的总黄酮提取物和BHT，混合均匀，将油脂放入65℃的烘箱中，每隔一定时间观察油脂的氧化效果及感官状态变化情况，设置空白对照。

1.3.5 羊奶果中总黄酮对黑腹果蝇SOD和GSH-Px活力的影响 为了进一步评价羊奶果中总黄酮的抗氧化能力，在自由基清除试验的基础上，采用果蝇模型对异黄酮的体内抗氧化活性[22]进行研究。

1.3.6 工艺流程 羊奶果→预处理→150℃恒温干燥→切块→乙醇溶液浸泡同时超声处理→过滤→上清液→浓缩→备用。

1.3.7 操作要点 将洗净的羊奶果切丝，放于烘箱中，调节温度至150℃，时间设定为12h;将烘干的羊奶果丝用小刀切为0.25mm×0.25mm的小块，于干燥处备用;取羊奶果果粉置于50mL的烧杯中，同时加入70%的乙醇溶液，置于试验室超声仪中，调整波长，定时10分钟后取出;将经过超声乙醇处理的羊奶果小块粗滤，去掉滤渣;将滤液置于UV-2601型紫外可见分光光度计中测定滤液的吸光度，并记录试验数据。

1.3.8 单因素试验 针对羊奶果中总黄酮的提取条件，固定其他条件下，分别从超声温度、液料比超声提取时间、超声波功率4个方面对羊奶果中总黄酮提取率的影响进行研究，取新鲜羊奶果进行试验，分别确定超声温度30～50℃、液料比3∶1～7∶1、超声提取时间20～40min、超声波功率90～210w等进行单因素试验

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波辅助乙醇提取温度 进行提取温度分别为30、35、40、45、50℃的单因素试验，经过3次平行实验，得出超声波辅助提取温度在40℃时得率更大，故选择35、40、45℃为响应面试验超声辅助提取温度的3个水平。

2.1.2 液料比 进行液料比分别为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1的单因素试验，经过3次平行实验，得出液料比在5∶1时得率更大，故选择4∶1、5∶1、6∶1为响应面试验液料比的3个水平。

2.1.3 超聲波辅助 进行超声波辅助提取时间分别为20、25、30、35、40min的单因素试验，经过3次平行实验，得出超声波辅助提取时间在30min时得率更大，故选择25、30、35min为响应面试验超声波辅助提取时间的3个水平。

2.1.4 超声波辅助提取功率 进行超声波辅助提取功率分别为90、120、150、180、210W的单因素试验，经过3次平行实验，得出超声波辅助提取功率在150（W）时得率更大，故选择25、30、35（W）为响应面试验超声波辅助提取功率的3个水平。

2.2 利用响应面法优化的工艺条件

2.2.1 响应面设计及结果 综合考虑单因素试验所得结果，以提取温度（℃）、液料比、超声辅助提取时间（min）、超声功率（W）作为响应因素，分别记作A、B、C、D。以总黄酮化合物得率（g·kg-1）作为响应值，记作Y，具体见表1。

考虑到超声辅助提取时间达到1h时，羊奶果中总黄酮化合物的溶出基本达到平衡，对得率影响不大，结合Box-Behnken8.0.6软件和Box-Behnken中心试验设计原理[18-20]，以羊奶果总黄酮得率为响应值，设计五因素三水平的响应面分析试验，响应面试验数据结果见表2。

利用DesignExpert8.0.6对数据进行多元回归拟合，方差分析及显著性检验，以总黄酮化合物的得率作为目标函数，对A，B，C，D的二次多项回归方程为：

Y=23.76+0.27×A+0.36×B+0.47×C+0.21×D-0.36×A×A-0.37×A×C+0.061×A×D+0.13×B×C+0.68×B×D+0.12×C×D+0.059×A2-0.53×B2-0.38×C2-0.42×D2

将上述结果做显著性检验，如表3所示：

方程的方差分析结果和回归模型各项系数的显著性检验结果和见表3。由表3可以看出，该回归模型的P=0.0003，远小于0.01，证明此数据分析结果的显著性为极显著，拟合模型较好，该试验的设计合理，误差较小，所以可以用此数学方程代替实验结果，各个因素对羊奶果中总黄酮的影响排序为：D>B>A>C，交互项对羊奶果中总黄酮类影响排序为AD>CD>BC>AB>AC>BD，二次项对羊奶果中总黄酮影响排序为：A>C>D>B。

2.2.2 交互作用对羊奶果中总黄酮得率影响的响应面分析 交互作用对羊奶果中总黄酮得率的影响响应面分析见图2。最佳试验条件为：超声波辅助提取温度为39.9℃，液料比为4.8∶1，超声时间为29.6min，超声波辅助提取功率为166.8W;为使得试验操作更为方便，最佳条件设定为：超声乙醇提取温度40.0℃，液料比为5∶1，超声波辅助提取时间为30min，超声波辅助提取功率为167.0W;为检验上述所得最佳试验条件的可靠性，连续做3组平行试验，利用上述最佳工艺条件提取羊奶果中总黄酮，得到羊奶果中总黄酮的平均提取量为25.0046g·kg-1，理论上可得到羊奶果中总黄酮的提取量为25.7581g·kg-1，二者之间相对误差为0.29%。

2.3 抗氧化效果

2.3.1 对DPPH自由基清除的能力 测定羊奶果中总黄酮提取物清除自由基的能力，以抗坏血酸VC作对照，结果见图3。各个不同溶液环境下，DPPH自由基浓度升高，各相对其清除率均有不同程度增长，同等浓度条件下抗坏血酸清除率比羊奶果总黄酮提取物的清除率好。但抗坏血酸在浓度达到0.06mg·mL-1时达到稳定，而羊奶果中总黄酮提取物在0.08mg·mL-1清除DPPH自由基效果维持稳定。

2.3.2 抑制油脂氧化的效果 对试验油脂进行观测发现油脂颜色及气味随时间发生不同程度的变化，空白组在2h以后油脂颜色加深，并在6h以后出现轻微哈喇味，各相油脂氧化速度明显不同。羊奶果中总黄酮提取物具有较强的对油脂氧化的抑制能力，且随添加浓度上升油脂氧化速度降低，但在同样条件下比BHT作用效果相对较弱。

2.3.3 对黑腹果蝇SOD和GSH-Px活力的影响 用含有0.5mg/g羊奶果总黄酮提取物的培养基饲喂果蝇，可使其SOD和GSH-Px活力显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）升高，表明一定剂量的总黄酮提取物能够增强果蝇清除体内活性氧的能力。

3 结论

最佳条件设定为：超声乙醇提取温度40.0℃，液料比为5∶1，超声波辅助提取时间为30min，超声波辅助提取功率为167.0W;为检验上述所得最佳试验条件的可靠性，连续做三组平行试验，利用上述最佳工艺条件提取羊奶果中总黄酮，得到羊奶果中总黄酮的平均提取量为25.0046g·kg-1，理论上可得到羊奶果中总黄酮的提取量为25.7581g·kg-1，两者之间相对误差为0.29%。低、高剂量组黑腹果蝇的SOD和GSH-Px活力均有所升高。用含有0.5mg/g羊奶果总黄酮提取物的培养基饲喂果蝇，可使其SOD和GSH-Px活力显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）升高，表明一定劑量的总黄酮提取物能够增强果蝇清除体内活性氧的能力。

参考文献

[1]韦庆龙，谭明玮.广西热带作物[M].南宁：广西人民出版社，2014：328-345.

[2]李石容，奶果中总黄酮的分离纯化及抗氧化活性的初步研究[D].湛江：广东海洋大学，2012.

[3]文开新，王成章，严学兵.黄酮类化合物生物学活性研究进展[J]，草业科学，2010（06）：119-126

[4]梁声记，陈怀庆，郑福林，等.羊奶果的加工利用研究[J].广西热作科技，2008（01）.

[5]陶阿丽，冯学花，宋祖荣，等.油梨粕中总黄酮提取工艺优化及其抑制α葡萄糖苷酶活性研究[J].中国油脂，2018.

（责编：王慧晴）