重组腺病毒载体Ad- EGFP- Klotho构建的实验研究*

贾 政,刘 茜,邢正江,邹弘麟,李亚雄△,魏 玲,韦 杰,李春城,孟凡棣

(1.昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科/云南省心血管外科研究所,昆明 650051；2.昆明医科大学附属延安医院老年医学科,昆明 650051；3.中国人民解放军联勤保障部队第920医院干部病房,昆明 650032)

Klotho基因于1997年首先由KURO- O等[1]在自发型高血压相关研究时发现，Klotho基因仅在部分器官表达，比如脑、心、肾、唾液腺等。研究表明，Klotho基因可以抑制经典型瞬时电位受体 (transient receptor potential canonical- 6,TRPC- 6)、胰岛素样生长因子(insulin- like growth factor,IGF)信号转导通路，改善内皮功能，增加一氧化氮(NO)活性并调节离子通道活性，增强机体抗氧化应激能力[2]。给予外源性Klotho或诱导内源性Klotho过表达对于钙磷异常代谢、内皮功能障碍、心肌纤维化等疾病发挥保护作用，可能成为其治疗的有效方法。据此，本研究以大鼠Klotho基因为目的基因，利用AdMaxTM腺病毒包装系统构建了绿色荧光蛋白(EGFP)标记的重组腺病毒表达载体，为相关疾病的基因治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株与细胞 本科室构建含有Klotho基因和EGFP基因的重组质粒，并向深圳百恩维生物科技有限公司购买AdMaxTM腺病毒包装系统、穿梭质粒pDC316- mCMV和骨架质粒，JM109感受态细胞及HEK293细胞由本科室保存。

1.1.2实验试剂 ExTaq酶、限制性内切酶NheⅠ、限制性内切酶NotⅠ及T4 DNA 连接酶均购自美国New England BioLab公司；Qiagen大规模质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司；Polyfectin脂质体、DMEM培养基、胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)、胎牛血清(FBS)、凝胶EDTA回收试剂盒购自美国Invitrogen公司;DNA引物合成、DNA测序均为美国Invitrogen公司；ViraBind腺病毒纯化试剂盒购自美国Cell Biolabs公司；Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker和去内毒素小量质粒抽提试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；RNAiso Plus、GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒、Go Tap®qPCRMsater Mix购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1引物设计 根据NCBI GenBank中大鼠Klotho mRNA编码序列(NM_031336.1)报告，应用Prime primer5.0软件设计特异性引物：上游5′- CTA CAG CAT CCG ACG AGG AC- 3′，下游5′- AGC AAA GTC ACA GGG AAA CG- 3′，在每条引物的前端加入相应的限制性内切酶位点和保护性碱基，选取NheⅠ(CAT ATG)和NotⅠ(GCG GCC GC)两个酶切位点。

1.2.2重组穿梭质粒pDC316- mCMV- EGFP- Klotho的构建及鉴定 同时用内切酶NheⅠ、NotⅠ对合成的Klotho基因及载体质粒pDC316- mCMV- EGFP进行双酶切鉴定。双酶切反应质粒体系包含NheⅠ1 μL、NotⅠ1 μL、pDC316- mCMV- EGFP质粒1 μg、缓冲液2 μL、牛血清蛋白(BSA)2 μL、ddH2O补足至20 μL，37 ℃孵育2 h。目的基因体系包括：Klotho PCR产物14 μL、缓冲液2 μL、BSA 2 μL、NheⅠ 1 μL、NotⅠ 1 μL，37 ℃孵育2 h。使用DNA凝胶提取试剂盒根据说明书操作进行回收，分别获得目的基因酶切产物和酶切质粒大片段。经纯化后，在22 ℃环境下，经T4 DNA连接酶作用将载体片段与目的基因片段连接，连接反应体系包含目的基因6 μL、T4 DNA连接酶1 μL、质粒大片段2 μL、10×DNA连接酶Buffer 1 μL，反应体系总共为10 μL，在22 ℃连接2 h。采用热休克法将10 μL上述连接产物与100 μL JM109感受态细胞进行转化培养，次日挑取LB平板上氨苄西林抗性的5个单克隆菌落并接种至10 mL培养基扩增，随后37 ℃摇床震荡培养20 h，根据去内毒素小量质粒抽提试剂盒说明书取3 mL菌液抽提质粒，经NheⅠ和NotⅠ双酶切鉴定和基因测序验证。需同时构建空白质粒pDC316- mCMV- EGFP作为对照。

1.2.3重组腺病毒载体Ad- EGFP- Klotho的包装 根据Polyfectin脂质体使用说明书，将鉴定正确的穿梭质粒pDC316- mCMV- EGFP- Klotho、骨架质粒采用脂质体介导的方法共同转染入HEK293细胞，进行细胞内同源重组，大量扩增，在高速离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清液，得到重组腺病毒Ad- EGFP和Ad- EGFP- Klotho。随后行PCR鉴定：取2 μL腺病毒，加2 μL胰蛋白酶K，56 ℃温育，沸水10 min后立即冰浴，在高速离心机上以最大速率短暂离心后取1 μL作为模板，加入特异性引物、dNTP 混合物及无核酸水进行PCR扩增。扩增反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环；72 ℃终末延伸15 min，所获PCR产物行电泳。

1.2.4重组腺病毒质粒Ad- EGFP- Klotho的扩增及纯化 将感染复数(MOI)=1的重组腺病毒载体Ad- EGFP- Klotho病毒液感染5×108个HEK293细胞，并置于37 ℃，5% CO2培养箱中扩增，随后每天观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)[5]，当出现完全CPE时即可收获细胞，-80 ℃/37 ℃反复冻融4次，随后4 ℃下高速离心5 min裂解细胞，离心并收集病毒上清液，根据腺病毒纯化试剂盒使用说明书纯化病毒。

1.2.5重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho转染HEK293细胞情况 将HEK293细胞按2×105接种于6孔板中，设置MOI=100，在转染前2～4 h加入不含血清的DMEM培养基500 μL，轻微混匀后置37 ℃，5% CO2培养箱孵育，期间每15分钟震荡培养基1次，2 h后去除培养基，加入2 mL含10% FBS的DMEM新鲜培养基，48 h后置于荧光显微镜下，观察细胞表达EGFP的情况。

1.2.6重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho的病毒滴度测定 为减少病毒损耗，应尽量避免反复冻融，采用10倍梯度倍比稀释法在96孔板中计算病毒滴度。经48 h感染，置于荧光显微镜下，计数荧光细胞情况。高稀梯度m的孔若数出N(N<10)个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10m/mL(m为稀释梯度)，若N>10，则需继续稀释，如果观察不清楚可先换PBS再进行观察，计数方法同前。采用计算公式[5]：半数组织细胞感染量(TCID50)=101+d(s-0.5)，再根据公式T=a×10bTC，ID50(单位mL)=10b-0.7PFU/mL进行换算。其中，T为1为最高稀释度的对数，d为稀释系数，s为阳性比率总和，a为阳性比率，b为滴度对数值，TC为组织细胞培养物，ID50为半数感染量。

2 结 果

2.1重组穿梭质粒pDC316- mCMV- EGFP- Klotho的鉴定 重组穿梭质粒经NheⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后发现，在3 045 bp处可见到目的基因Klotho片段，在6.7 kb处可见到穿梭质粒pDC316- mCMV片段(图 1)，与预期一致。从Ad- EGFP- Klotho重组腺病毒样品中可以检测到3 045 bp的条带，表明目的基因已成功整合在病毒基因组中(图2)。经基因测序显示，Klotho基因片段与原始序列比对相符。

1、2：pDC316- MCMV- EGFP- KlothoNheⅠ+ NotⅠ双酶切鉴定结果；M:DNA分子标记物

图1重组穿梭质粒pDC316-CMV-EGFP-Klotho酶切鉴定结果

2.2重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho的鉴定 重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho转染HEK293细胞，转染8 d后细胞表现出CPE现象，置于荧光显微镜下观察，可见大量表达EGFP,见图3。

M:DNA分子标记物；1：Ad- EGFP- Klotho病毒原液；2：Ad- EGFP- Klotho病毒10倍稀释液

图2重组腺病毒Ad-EGFP-KlothoPCR鉴定结果

A：HEK293细胞转染后24 h，细胞仍贴壁生长，未见变大、变圆等现象，并可见EGFP表达;B:HEK293细胞转染8 d后，可见HEK293细胞出现CPE现象并大量扩增，EGFP广泛表达

图3Klotho和EGFP转染后到获得重组腺病毒的EGFP表达图

2.3重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho感染HEK293细胞的效率 当MOI=100时，重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho转染HEK293细胞24 h后，细胞生长情况良好，无污染，荧光显微镜下可见满视野HEK293细胞表达EGFP，感染效率达91.75%，见图4。

A：转染24 h；B:转染60 h

图4重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho感染HEK293细胞扩增病毒效率图

2.4重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho的滴度测定 经反复感染、扩增、包装、纯化及浓缩，可获得高滴度重组腺病毒Ad- EGFP- Klotho。测定病毒滴度为2.0×1010Tu/mL，高于对照组(Ad- EGFP)的滴度，满足后续实验要求。

3 讨 论

Klotho基因位于染色体13q12区域[6- 7]，由5个外显子和4个内含子组成，全长大约50 kb。人、小鼠和大鼠的外显子长度分别为3 022、3 036、3 042 bp，且以上三者Klotho基因之间存在同源性(人和小鼠80%，人和大鼠83%)，第三外显子区域存在一个固有的供体剪切位点，可进行选择性剪切。根据选择性剪切后，转录两种产物：跨膜型和分泌型Klotho蛋白。研究显示，跨膜型Klotho蛋白相对分子质量为130×103，全长编码1 014个氨基酸，该蛋白包含1个N- 末端信号序列，1个单跨膜螺旋区域，1个短胞内区域和1个胞外区域[8]。单跨膜螺旋区域贴近C- 末端，胞外区域又分为2个固有的重复序列KL1和KL2，中间又存在1个短的延伸基础氨基酸序列(赖氨酸- 赖氨酸- 精氨酸- 赖氨酸)。研究还表明，血液中分泌的Klotho蛋白可作为调节各种靶器官的激素，对心血管系统有保护作用[9- 12]。Klotho蛋白对血管内皮细胞具有抗氧化应激，抗炎和抗细胞凋亡作用。

本研究采用病毒载体系统将目的基因导入靶细胞。研究显示，导入系统不依赖于宿主细胞基因组整合的基因递送载体[13]，为基因转导提供了若干优点，主要是避免插入诱变和位置效应异常。然而，除非设计用于复制和分离，否则非整合载体将在增殖细胞中逐渐稀释，并且不能免除表观遗传效应。这些用于编辑细胞基因组的方法还允许将表达盒靶向整合到“安全港”，例如19号染色体上的AAVS1位点或内源基因座。为了实现这点，表达盒必须侧接核酸酶切位点周围的DNA以指导同源修复并且还可以有效递送，例如用非整合的慢病毒载体[14]。目前，腺病毒载体作为广泛使用的病毒载体之一，血清5型腺病毒运用最广，它具有安全性高、免疫原性低、感染效率高、宿主广泛、能介导基因的长期稳定表达、所制备的病毒滴度高、高效转导目的基因、物理性质稳定、不整合入宿主细胞基因组、致病性低的优点，且具有分别转染静息期及分裂期细胞，对各种细胞和组织亲嗜性差异等特点[15]。因此，腺病毒载体可以广泛应用于各领域基因治疗，故本研究根据其特点选用5型腺病毒作为载体进行目的基因重组。

本研究使用的AdMaxTM腺病毒载体系统在HEK293细胞中，经Cre酶催化，产生的催化效率较前大大提高。ST GEORGE等[16]对腺病毒载体的研究结果显示：目的基因不超过8 kb，几乎全部重组腺病毒都能够有效携带，并在细胞中稳定表达、产率高。除此之外，与其他启动子相比，本研究所使用的mCMV启动子作用更强，目的基因能够高水平表达，并且所构建的穿梭质粒中携带EGFP基因，能够在荧光显微镜下直观评估重组腺病毒转染HEK293情况和感染细胞扩增效率情况。

本研究证明，已获得2×1010Tu/mL的高滴度重组腺病毒载体Ad- EGFP- Klotho，该重组腺病毒载体含有目的基因Klotho，可高表达EGFP，能够满足后续研究，甚至为临床研究提供了研究依据。