湿法消解/干灰化-氢化物发生-原子荧光光谱法测定基围虾中总砷

林建奇 刘海涛 甄长伟 王 威 蓝 图 姚梦楠

(1北京海光仪器有限公司，北京 100015；2中国地质装备集团有限公司，北京 100102)

前言

我国是水产品生产和消费大国。自从生猛海鲜纷纷上餐桌之后，基围虾便成了我们口腹之中的“常客”。基围虾生于咸淡水交界处，是一种近岸浅海虾类，能耐低氧，具有潜底习性，杂食性强，以污泥藻类等为食[1-3]。随着高密度集约化养殖技术的推广，水产养殖业得到迅猛发展，水产品质量安全也越来越得到重视和关注[4-6]。LEMLYAD[7]通过全球环境安全研究，得出水产品可以通过对水中的砷、汞、镉、铅等重金属进行蓄积，进而危害人体健康。

目前，砷元素作为食品卫生安全管控指标之一，正是由于其毒理特殊性。最常见的砷化合物为砷的氢化物或胂、五氧化二砷和三氧化二砷，及其对应的水化物为砷酸和亚砷酸。一些重要的生物砷化合物：一甲基胂、二甲基胂、三甲基胂、甲基胂酸、二甲基次胂酸等。其中，无机砷的毒性最强[7]。而基围虾作为强杂食性物种，极容易蓄积各种形态的砷化合物。为了客观地反应总砷的含量，GB5009.11—2014规定食品中总砷及无机砷的测定，主要方法有：电感耦合等离子体质谱法、氢化物发生原子荧光光谱法、银盐法[8]。国家标准采用湿法消解和干灰化法对样品进行消解，而戚荣平等[9-10]均做过对海产品的不同处理，由于有机砷耐热性强，所以湿化学消解很难彻底将其解离；而干灰化法处理高蛋白的基围虾，易出现剧烈燃烧喷溅。二者处理方法均使得测定结果偏低。因此，单纯使用其中方法之一很难准确、彻底地测定总砷含量[9-11]。根据实际情况，结合湿法消解法和干灰化法对基围虾样品进行消解，可较好地解决基围虾样品消解不完全的问题，同时采用高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪对单一湿法消解液和混合消解液进行砷形态分析，考察差异性。本文建立了湿法消解/干灰化混合前处理方法，可将基围虾样品中的有机砷全部转化为无机砷，实现氢化物发生-原子荧光光谱法准确、可靠地测定基围虾样品中总砷。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

AFS-9560双道四灯全自动原子荧光光谱仪 (北京海光仪器有限公司)，LC-AFS-9560高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪(北京海光仪器有限公司)，PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)阴离子交换柱(瑞士哈密尔顿公司)，0.45 μm微孔滤膜(天津津腾公司)，砷空心阴极灯(北京有色金属研究院)，SECURA224-1CN(万分之一)电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，UPW-20N超纯水机(北京历元仪器公司)，LK-2000A粉粹机(新昌县城关红利数控厂)，EH35A plus电热板(北京莱伯泰科有限公司)。

砷形态标准储备溶液：砷甜菜碱(GBW08670)、砷酸根(GBW08667)、亚砷酸根(GBW08666)、一甲基砷(GBW08668)、二甲基砷(GBW08669)均购自中国计量科学研究院。

砷标准储备溶液：砷元素单标(GBW08611)均购自中国计量科学研究院。

盐酸、硫酸、硝酸为优级纯；硼氢化钾、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫脲、氧化镁、硝酸镁为分析纯；分析用水为超纯水；氩气纯度为99.99%。

还原剂：称取硼氢化钾10 g、氢氧化钠2.5 g用超纯水溶解，定容至500 mL，混匀。

载流：量取100 mL盐酸，加入900 mL超纯水，混匀即为盐酸(10%)溶液。

硫脲溶液：称取10 g硫脲，加入100 mL超纯水，混合即为硫脲溶液(100 g/L)。

所用器皿均采用硝酸溶液(20%)浸泡，并清洗干净烘干。

1.2 标准系列溶液配制

通过逐级稀释砷标准储备溶液，配制成1 mg/L的砷标准溶液。取25 mL比色管，先加入1.25 mL盐酸以及2.5 mL硫脲溶液，最后加入一定量的1 mg/L砷标准溶液，纯水定容，摇匀，配制成0、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/L的标准系列工作溶液。

1.3 仪器工作条件

原子荧光光谱仪条件：光电倍增管负高压280 V；砷空心阴极灯电流60 mA (主电流) 30 mA(辅电流)；读数时间16 s，延迟时间3 s；原子化器高度9.0 mm；氩气流量：载气400 mL/min，屏蔽气900 mL/min；蠕动泵转速60 r/min；还原剂为氢氧化钠(5 g/L)+硼氢化钾(20 g/L)；载流盐酸(5%)。

热消解条件：电热板预消解，50 ℃保持20 min，100 ℃保持30 min，160 ℃保持3 h；马弗炉灰化，300 ℃保持3 min，550 ℃保持6 min。

高效液相色谱-原子荧光联用仪条件：光电倍增管负高压300 V；砷空心阴极灯电流60 mA (主电流)，30 mA(辅电流)；原子化器高度9.0 mm；氩气流量：载气400 mL/min，屏蔽气900 mLmin；蠕动泵转速70 r/min。流动相：磷酸二氢钾(10 mmol/L)和磷酸氢二钠(1 mmol/L)，流速1 mL/min；进样量100 μL；还原剂氢氧化钠(5 g/L)+硼氢化钾(40 g/L)；载流盐酸(10%)。

1.4 样品前处理

虾样选自大型超市和农贸市场。取新鲜虾，剥掉虾头和虾壳，于冰箱冷冻。采用粉粹机将冷冻的虾粉粹均匀。采用塑封袋密封，冰箱冷藏，备用。

1.5 样品灰化

取0.1 g(精确至0.000 1 g)虾样于50 mL石英坩埚，加入6 mL硝酸，盖上表面皿静置冷消解120 min。置于电热板上，50 ℃保持20 min，100 ℃保持30 min，160 ℃保持3 h至消解液成微黄色澄清。取掉表面皿，160 ℃赶酸至消解液约1 mL，加入2 mL硝酸镁溶液(500 g/L)，继续赶酸至蒸干。之后，盖上石英坩埚盖，移入马弗炉，300 ℃保持3 min，650 ℃保持6 min。取出冷却，加入盐酸溶液(5%)溶解并转移至25 mL的比色管中，加入2.5 mL硫脲溶液，最后盐酸溶液(5%)定容，摇匀待测。同时做试剂空白实验。

2 结果与讨论

2.1 氢化物发生条件优化

氢化物发生-原子荧光光谱法作为元素分析的测试手段，利用蠕动泵或者注射泵实时将还原剂、样品以及载流引入反应模块进行氧化还原反应，在载气氩气的作用下，将反应产生的气态砷化氢导入原子化器检测。基于动态反应流路机理，进样需要平稳，而且一定浓度的还原剂和载流关系着反应的彻底、完整和稳定性，进而达到优化的灵敏度。原子荧光光谱仪部分采取载气流量400 mL/min，屏蔽气流量900 mL/min，还原剂浓度为氢氧化钠(5 g/L)+硼氢化钾(20 g/L)；载流选择盐酸作为主要反应酸介质，酸度为盐酸(5%)[12-13]。

2.2 样品消解方式选择

传统意义上，样品的消解方式主要为湿法消解和干灰化消解[11]。针对富含蛋白质和高有机质的虾样品，分别采用以下方式处理，研究消解方式对于虾样品的测定影响(称样量为0.1 g)。

2.2.1 湿法消解

往样品中加入5 mL硝酸和2 mL硫酸，静置冷消解2 h，电热板上50 ℃保持20 min，100 ℃保持30 min，180 ℃保持1 h，300 ℃保持2 h至消解液澄清淡黄色，冷却转移，待测。

2.2.2 干灰化法消解

将样品于电热板上100 ℃进行干燥去除水分，加入2 mL硝酸镁溶液(500 g/L)，继续蒸干。移入马弗炉，150 ℃保持2 min，300 ℃保持5 min，550 ℃保持5 min。取出冷却，加入盐酸溶液溶解干灰，转移，待测。

2.2.3 湿法-干灰化消解

按样品灰化处理方法进行处理，待测。

将以上不同的消解方式，同时上机测定，得出差异如图1所示。明显地，湿法/干灰化消解的测定结果最高。在消解过程，虽然湿法消解加入高沸点的硫酸提高电热板极限温度进行消解，但是部分有机砷的高耐热性，仍然未能完全彻底消解虾样品。而高蛋白质和有机质的虾样，通过蒸干方式，直接进入马弗炉高温燃烧，实验过程出现爆燃飞溅现象，导致样品损失，所以纯粹的干灰化法测定结果最低。

图1 不同消解方式对检测结果的影响Figure 1 Influence of different digestion methods on test results.

2.3 湿法/干灰化消解对样品中砷形态的影响

将基围虾样品进行砷形态提取[14-15]，以及对不同样品消解方式所得的消解液，采用0.45 μm微孔滤膜过滤。采用高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪测定提取液和消解液中五种砷形态：砷甜菜碱(AsB)、三价砷(AsⅢ)、DMA(二甲基胂)、MMA(一甲基胂)、五价砷(AsⅤ)。由图2得出，基围虾样中含有大量的有机砷，而无机砷相对很少。而且，不同的消解方式均对不同的砷形态产生一定的影响，湿法消解还存在相当量的有机砷没有彻底消解，干灰化法虽然爆燃损耗，但是基本都转化为五价砷，湿法/干灰化消解均将所有砷形态转化为无机砷，且均被氧化为五价砷。

图2 不同消解方式对基围虾样品中的砷形态影响Figure 2 Effects of different digestion methods on arsenic morphology in shrimp samples.

2.4 辅助灰化剂的影响

由于砷在高温615 ℃时，容易升华损失。那么，在马弗炉灰化过程，为了避免砷元素的挥发损失，在样品中加入辅助灰化剂如硝酸镁、氧化镁等。为了研究不同灰化剂对测定的影响，实验了样品直接灰化、样品加入硝酸镁再灰化、样品加入氧化镁再灰化、样品同时加入硝酸镁和氧化镁再灰化。通过不同的灰化处理，测定结果如图3所示，样品加硝酸镁和样品加硝酸镁、氧化镁的测定结果浓度最高，二者差别不大。显然，氧化镁在基围虾样品的灰化过程作用不大，但是硝酸镁起到关键作用，明显遏制了砷的挥发，为准确的总砷测定提供保障。实验采用在基围虾样品中加入硝酸镁作为辅助灰化剂。

2.5 标准曲线以及方法检出限

在此优化条件下，砷元素的荧光灵敏度IF与浓度C在质量浓度0.0～20.0 μg/L范围内成线性关系，标准曲线方程为IF=184.62C-5.96，线性相关系数r为0.999 6。连续测定11次样品空白(样品空白为取一定量超纯水，和样品保持一致的处理过程)，对样品空白荧光强度进行计算SD，根据DL=3×SD/K(K是标准曲线斜率)计算。经过测定，空白荧光值分别为2.36、4.35、1.86、0.25、5.26、1.12、0.46、2.38、3.45、2.15、3.26，计算检出限为0.025 μg/L。

图3 辅助灰化剂的影响Figure 3 Influence of auxiliary ashing agent.

2.6 方法精密度

分别对每个基围虾样品平行处理7次，并对这7个样品进行测定，计算方法的精密度(见表1)。结果表明，方法的相对标准偏差范围在2.5%～3.1%。精密度结果较佳，确保方法的稳定、可靠性。

表1 方法精密度实验Table 1 Method precision experiment(n=7)

2.7 加标回收实验

按精密度测定基围虾样品结果，取平均值，分别对3个样品加标5 μg/L和10 μg/L，结果见表2，计算得到的加标回收率范围为93.6%～103%，方法准确。

表2 加标回收实验Table 2 Labeling recovery experiment

2.8 方法准确性实验

取GBW08572对虾标准物质成分，作为本方法的准确性验证对象。按湿法/干灰化法，依次对对虾标准物质进行处理，平行处理3份，测定结果见表3。测定值基本在标准值范围，偏差很小，测定结果准确、可靠。

表3 标准物质测试Table 3 Test of standard substance

3 结论

采用湿法消解/干灰化法-氢化物发生-原子荧光光谱法测定基围虾中总砷的方法。在优化条件下，样品加入硝酸经电热板预消解后进行马弗炉干灰化处理，确保将基围虾中的有机砷全部转化为无机砷，同时避免实验过程中砷元素的损失。在此过程研究了不同消解方式对基围虾中砷形态的影响，湿法消解/干灰化法处理基本可以将所有的砷形态转化为无机砷。方法准确、可靠，有效克服了高蛋白质以及富含有机质的基围虾在消解过程中很难将所有有机砷转为无机砷的困难，可适用于基围虾等其他海产品的总砷测定。