不同有机物料及其菌根化对甜玉米产量与品质的协同影响

金海如，蒋湘艳，夏婷婷

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004）

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，简称AM）真菌是一类可以与植物根系很好形成共生关系，且分布最为广泛、数量最多的内生菌根真菌［1］，其菌丝包括根内菌丝（Intraradical Mycelium，IRM）和根外菌丝（Extraradical Mycelium，ERM），ERM可以深入土壤中，扩大根系吸收面积，进而促进寄主植物对水分及矿质元素氮、磷、钾、硫等的吸收［2］。共生体的存在会增加植物生物量，提高光合作用［3］。AM 真菌促进宿主植物生长的同时，也依赖植物通过光合作用产生的碳水化合物传递给AM 真菌作为其碳源［4］。研究表明植物缺氮导致叶细胞偏小，水分传导率降低。缺磷引起根细胞壁弹性减少、抑制叶的生长。氮、硫等养分缺乏直接影响叶绿素和蛋白质的合成［5］。关于AM 真菌吸收土壤中氮磷的分子基础和基因调控方面已取得了重要成果，Jin 等［6-7］证明菌根真菌吸收氮源以精氨酸（Arg）的形式从ERM 转运到IRM。IRM 内Arg 通过尿素循环分解为尿素和鸟氨酸（Orn）。尿素通过脲酶（urease）分解为NH3和CO2，Orn 则由相关酶的作用进一步转化为谷氨酸再利用。而磷进入到真菌胞质，以多聚磷酸盐（PolyP）的形式从ERM 运输到IRM，被质膜上的磷转运蛋白（Pi-transport protein）转运 到 植 物 体 内［8］。PloyP 在IRM 中 裂 解 的 同 时释放Arg，促进Arg 裂解成氨随后转运到菌根界面［9-10］，说明菌根内氮和磷的运输是相关联的。

目前我国过量施用化肥已到极限，以氮肥为例，我国氮肥平均使用量是近美国的3 倍、澳大利亚的8 倍多［11］。这造成一系列的资源、生态和环境问题，化肥与农药的滥用使得水资源和土壤污染严重［12］。所以将菌根作为一种“生物菌肥”将对农业的增产有很大的帮助，其为发展绿色有机农业起到关键性的作用［13-14］。

目前，有关如何有效提高玉米产量和品质的研究很多。朱红英［15］研究了控释肥料对玉米的影响效应。黎阳燕［16］研究了猪粪和化肥配施对玉米影响。Smith 等［17］关于AM 真菌对玉米等作物生长的作用进行了概述。Baum 等［18］介绍了AM 真菌生物肥料提高蔬菜作物产量和产品质量。尽管关于AM真菌分解有机质并吸收释放氮，进而输运给寄主植物吸收利用的研究已经很多报道［19-22］，这些都是在人工设计的基质及在实验室完成得出的结论。当前关于泥炭、泥灰和有机肥等有机物料对田间种植的菌根化甜玉米生长和品质的实际影响还不清楚。泥炭、泥灰和有机肥中含有植物生长所必需的矿质元素，如氮和磷元素等。本文以甜玉米为寄主植物，以AM 真菌为接种菌剂，以泥炭、泥灰和牛粪有机肥为有机物料，在接菌条件下，研究不同有机物料对玉米籽粒氮磷含量、菌根精氨酸含量、籽粒淀粉及可溶性糖含量、蛋白质组分及氨基酸组分等的影响，从而探究不同有机物料对菌根化玉米生长及品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

以金华玉米（东糯4 号）为宿主材料，选取500 粒颗粒饱满的玉米种子，用10%的H2O2浸泡10min 左右，然后用去离子水漂洗干净，再浸泡5h，分别播种于121℃经2h 灭菌的沙子和草木灰混合的培养基质中，其中不加添加剂为空白对照。沙子中添加剂的量，由其中含有的磷元素的量决定，保证草木灰混合基质中磷的含量为10mg/kg。分别接种AM 真菌菌剂1mL（孢子含量约为200个），不加菌的为对照组（CK）。每个处理设置15 个重复，共4×15×2=120 盘，每个培养杯有32 盘，共需4 个培养杯。将处理好的培养杯放于智能光照培养箱中培养20d 左右，期间施加一次限氮限磷的Hoagland 营养液。玉米菌根侵染率达到60%时，移栽至试验田中。同时添加的有机物料为泥灰（磷含量：20mg/kg）、泥炭（磷含量：200mg/kg）、有机肥（磷含量：1000mg/kg），每株处理加有机物料250g，期间15d 施加一次限氮限磷的Hoagland 营养液。

1.2 试验地点

育苗期：在生化智能培养箱，光照12h，无光照12h。生长期：金华汤溪镇寺平稻米合作社试验田。生长60d 后收获，进行各项指标的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 样品重量测定

将甜玉米分为地上部植株和穗，另外收集菌丝室ERM。将菌根室的根系和菌丝室的ERM 洗净后用纸吸干，用电子天平分别称量植株和穗重及ERM 鲜重。幼苗株高采用刻度尺测量。

1.3.2 根系侵染率测定

采用曲利苯蓝染色-方格交叉法［23］测定菌根侵染率。具体步骤为：（1）根样采集：从不同处理组的甜玉米根系不同位置选取较细的根并剪成1cm左右长的根段，将剪好的根段放置试管底部，备用。（2）透明：向放置根段的试管中加入10%的KOH，将根段浸没即可。再将试管90℃水浴加热2h。（3）清洗：将处理后的KOH 倒出，并用自来水反复清洗试管中根段，直到漂洗的水不再呈黄色为止。（4）软化：向放置清洗过的根段的试管中加入软化剂（10%H2O2），浸没根段。室温条件下放置1h。（5）酸化：重复步骤3 清洗步骤。接着向放置根段的试管中加入酸化剂（1%HCl 溶液）酸化10min。（6）染色：重复步骤3 清洗步骤。向放置根段的试管中加入染色剂，并浸没根段。于90℃水浴中染色1h。（7）脱色：将染色好的根段染色剂倒掉，用自来水清洗数次。接着向处理好的根段中加入脱色剂（乳酚），脱色30min，倒掉脱色剂，用自来水清洗数次。再重复步骤7 一次。（8）镜检：从不同处理组中已染色的根系中分别挑取40 根根段于培养皿中进行镜检测定，并计算出甜玉米菌根侵染率。

1.3.3 总氮、总磷和精氨酸含量测定

将甜玉米籽粒冷冻干燥处理后，籽粒总氮含量采用凯氏定氮法［24］；总磷含量采用钼锑抗显色法［25］。菌根精氨酸含量参照郝刚等［26］实验方法，用甲萘酚-双乙酰法测定。

1.3.4 蛋白质组分提取和分析

蛋白质组分分离用逐步提取法［27］。（1）总蛋白提取：分别称取不同处理的玉米粉1g 放入研钵中，加5mL 蒸馏水，将籽粒研磨成匀浆，将匀浆倒入锥形瓶中，再分别向锥形瓶中加入0.4%NaOH 溶液20mL。放入65℃水浴锅中提取5h。冷却至室温，11000r/min 离心20min。取上清液，即为总蛋白提取液。（2）清蛋白提取：取玉米粉1g，置于研钵中，加15mL 蒸馏水，研磨至匀浆。将研磨好的材料转移至离心管中。11000r/min 离心20min。将提取液用蒸馏水定容至50mL。即为清蛋白提取液。（3）球蛋白提取：向（2）中离心管的残渣中加入10mL 的10%NaCl 溶液，用玻璃棒搅匀，同上离心。将提取液用10%NaCl 定容至50mL，得到球蛋白提取液。（4）醇溶蛋白提取：向（3）中盐溶液提取后的残渣中加入10mL 的75%乙醇溶液。用玻璃棒搅拌，将混合液放在80℃热水中加热5min。同上离心，取上清液至烧杯中，向离心管中再加入75%乙醇（重复3 次）。将提取液用75%的乙醇溶液定容至50mL。即为醇溶性蛋白提取液。（5）谷蛋白的分离：向（3）中醇提取的残渣中，加入0.2%的NaOH 溶液10mL，用玻璃棒搅拌15min，离心，取上清液于烧杯中（重复3 次）。将提取液用0.2%的NaOH 溶液定容至50mL，即为谷蛋白提取液。测蛋白含量所需染液：考马斯亮蓝G250（0.01%），蛋白质含量测定采用凯式定氮法。

1.3.5 可溶性糖和单糖组分含量测定

可溶性糖提取步骤：称取玉米粉0.5g，放入研钵中，加入5mL 蒸馏水磨成匀浆，转入锥形瓶中，再用10mL 的蒸馏水冲洗研钵3 次，洗出液也转入锥形瓶中。处理好的样品在沸水浴中提取1h，冷却后过滤并定容至100mL，即为待测液。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法［28］。单糖组成分析采用薄层色谱法［29］。

1.3.6 氨基酸组分测定

氨基酸组分测定采用氨基酸自动分析仪法［科标技术（青岛）研发中心］。

1.4 数据分析

采用SPSS22.0 软件进行方差分析和样本平均数的显著性分析。采用Orign8.0 软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同有机物料对菌根化玉米的生物量及菌根侵染率的影响

由表1 可知：大田试验中，施加不同有机物料条件下，接种AM真菌较不接种AM 真菌时玉米生物量显著提高，菌根化甜玉米较正常玉米幼苗期的株高高出17.5%，穗重和株重提高了6.4%和5.28%。接菌条件下，施加有机物料泥炭或泥灰时，幼苗株高显著提高，分别为40.50 和39.92cm，比正常玉米幼苗期的株高高出25.01%和23.21%，穗重和株重提高13.13%和11.41%；而施加有机肥时，幼苗株高比空白组显著降低，甚至有抑制生长现象。接菌条件下，施加有机肥时穗重和株重最高，分别为301.16 和334.50g，比空白组提高了49.53%和67.83%，且菌根侵染率提高27.7%。

表1 有机物料对菌根化玉米生物量及菌根侵染率的影响

2.2 不同有机物料对菌根化玉米籽粒氮磷含量及菌根精氨酸含量的影响

如图1 所示，接种AM 真菌玉米籽粒中总氮含量总体比不接种菌时显著提高。在接种菌剂条件下，施加泥炭时籽粒中总氮含量最高，泥灰次之，比空白组籽粒中总氮含量高17.6%。菌根化甜玉米籽粒总磷含量比正常玉米提高了50.2%，施加有机肥时，菌根化玉米籽粒总磷含量提高75.1%。施加其他有机物料时效果不明显。

施加不同有机物料时，AM 真菌吸收的氮营养不同，从而AM 真菌组织中产生的Arg 也有所差异。接菌后，施加泥炭和泥灰，玉米根部Arg 含量最多，分别为3.38 和2.97mg/g，有机肥次之，空白组含量最少，且差异显著。

2.3 不同有机物料对菌根化玉米籽粒淀粉和可溶性糖含量的影响

图1 不同有机物料对菌根化玉米籽粒氮、磷及菌根精氨酸含量的影响

图2 不同有机物料对菌根化玉米籽粒淀粉和可溶性糖含量的影响

如图2 所示，施加不同有机物料时，接种AM真菌均提高了玉米籽粒可溶性糖和淀粉含量。菌根化玉米籽粒中淀粉和可溶性糖含量因有机物料种类不同而异。淀粉含量为：泥灰＞泥炭＞有机肥＞空白。可溶性糖含量也呈此趋势，且施加泥灰的玉米籽粒中糖含量为90.3mg/g，比空白组增加近一倍。此外，对籽粒中的多糖进行水解，利用薄层层析快速分析其中单糖种类及含量。由图2 可得，展开系统中分离出标准葡萄糖，所对应的斑点的Rf 值为0.12。分析不同处理组水解所得单糖斑点位置与标准葡萄糖位置基本相同，Rf 值在0.12 左右。初步判断不同处理组水解得到单糖主要为葡萄糖。显色后发现菌根化玉米籽粒中施加泥灰和泥炭时葡萄糖斑点较深，说明这两个处理中葡萄糖含量最高。此结果与不同处理组籽粒中淀粉和可溶性糖含量相对应。

2.4 不同有机物料对菌根化玉米籽粒蛋白质及其组分含量的影响

由表2 可知，AM 真菌菌根化玉米与正常玉米相比籽粒中的总蛋白增加12.25%，而施加泥炭和泥灰时，玉米籽粒中的总蛋白显著高于对照组约20.1%，所以AM 菌根化和施加有机物料可以协同提高其氮素营养。接菌情况下，蛋白质总量因有机物料不同而存在差异。施加泥炭时，总蛋白含量最高，为10.68%；泥灰次之，为10.21%；有机肥为8.86%。施加不同有机物料两种结构蛋白含量没有显著差异，且均低于贮藏蛋白含量。醇蛋白和谷蛋白含量因添加物料的不同具有显著差异。施加泥炭和泥灰时，醇溶蛋白和谷蛋白含量相对较高。

表2 籽粒蛋白质及其组分含量（%）

2.5 施加泥炭条件下菌根化玉米籽粒氨基酸组分分析

由表2可知，施加泥炭时菌根化玉米籽粒蛋白质含量相对较高，于是对其中水解氨基酸含量进行分析并与空白组进行对照。从表3 可看出玉米籽粒中含有16 种水解氨基酸成分。其中包括8 种人体必需氨基酸，即蛋氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸。施加泥炭时菌根化玉米籽粒每种氨基酸组分均大于空白组，总氨基酸含量提高14.98%。

3 小结与讨论

AM 真菌作为微生物肥料，可广泛应用于小麦、玉米、水稻、高粱等［30］，施加后有利于植株根系吸收有机物中矿质元素氮和磷［7，31-33］，明显改善植株的营养代谢。而泥炭、泥灰和牛粪有机肥中富含植物生长所需的氮（分别为1.8%、0.05%、1.0%）和磷（分别为0.15%、0.55%、0.5%）等矿质元素。本研究发现菌根化甜玉米比正常玉米幼苗期的株高高出17.5%，穗重和株重提高了6.4%和5.28%。在施加泥炭、泥灰和有机肥以后，比单纯的菌根化甜玉米幼苗期的株高高出8%，穗重和株重提高近一倍，尤其是有机肥更加显著。施加有机肥时幼苗生长缓慢甚至有烧苗现象，可能是由于有机肥沤肥时间过短，但在植株生长后期有促进作用。这说明了菌根化和施加有机物料可以协同提高甜玉米产量，与近来Thirkell 等［34］发现了AM 真菌可以分解田间的有机质并且促进了寄主植物对氮素等营养的吸收及其产量的提高的结论一致。

表3 玉米籽粒中水解氨基酸组分及其含量（%）

施加AM 真菌和有机物料可以协同提高甜玉米的营养品质。菌根化甜玉米籽粒总磷含量比正常玉米提高了50%，施加有机肥时，菌根化玉米籽粒总磷含量提高75.1%。施加其他有机物料时效果不明显，甚至比空白组含磷量更低。说明有机肥中可能含有较丰富磷元素供玉米植株生长。Willmann 等［35］的研究也发现了在菌根化玉米中低磷条件下主要是磷运输蛋白Pht1;6 对磷的吸收贡献最大，这个蛋白基因也负责控制玉米生物量的增加和穗的产量。接种AM 真菌玉米籽粒中总氮含量比不接菌时显著提高。在接种菌剂条件下，施加泥炭时总氮含量最高，泥灰次之，空白组籽粒中总氮含量最低。这是因为有机物料如泥炭和泥灰中含有氮元素，泥炭含有氮1.8%，泥灰只含有少量氮素，可以为植株提供营养。AM 真菌吸收土壤中外源氮传递到植物过程中，Arg 是氮素营养由根外菌丝传递到根内菌丝再传递给植物供其吸收的氮素载体［7，33］。菌根Arg的含量反映了氮素的吸收效率。该实验发现施加泥炭和泥灰时菌根Arg 含量较高，进一步表明Arg 的积累与玉米氮素吸收有直接相关性。说明AM 真菌与植株共生时，可以帮助玉米植株根系吸收土壤中氮素养分。

此外，AM 真菌菌根化玉米与正常玉米相比籽粒中的总蛋白增加12.25%，而施加泥炭和泥灰时，玉米籽粒中的总蛋白显著高于对照组约20.1%，所以AM 菌根化和施加有机物料可以协同提高其氮素营养。蛋白质的组分是评价籽粒品质的一个重要指标。根据蛋白质在溶剂中的溶解特性可将籽粒中的蛋白质分为4 种类型，包括属于结构蛋白的清蛋白和球蛋白及属于贮藏性蛋白的醇溶蛋白、谷蛋白［27］。研究表明菌根化玉米籽粒中不同处理组的贮藏蛋白的含量均高于结构蛋白，这与张海艳等［36］的研究即醇溶蛋白等储存蛋白对总蛋白含量影响最大的结论一致。此现象与Stone 等［37］的研究，即清蛋白和球蛋白作为结构蛋白在籽粒生长早期迅速积累，随着籽粒胚乳物质灌浆充实而逐渐减少，醇溶蛋白和谷蛋白作为贮藏蛋白在籽粒生长后期积累较快的结果相符合。氨基酸是蛋白质合成的基本单位，本文对蛋白质含量相对较高的泥炭组处理的菌根化玉米籽粒进行氨基酸组分分析，检测出16 种水解氨基酸且含量均高于空白组，其中包括8种人体必需氨基酸。邵金良等［38］研究得出玉米籽粒水解氨基酸中谷氨酸、亮氨酸含量较高。这与本实验结果一致。所以施加泥炭时能提高玉米籽粒中氨基酸的含量，特别是8 种必需氨基酸，从而大大改善玉米营养。菌根化甜玉米与正常玉米相比，在淀粉和可溶性糖含量上提高不明显，但是施加有机物料特别是泥灰后可溶性糖增加近一倍。

综上所述，有机物料和AM 真菌对寄主植物甜玉米产量及营养具有协同作用。验证了国外专家［19-22］研究发现AM 真菌可以分解土壤中的有机质并且吸收大量的氮素的结论。此外，Cheng 等［39］发现提高CO2促进土壤有机碳的分解，其中的机理是土壤有机质分解产生可以利用的NH4+，由AM 真菌吸收后转递给寄主植物的根部进而促进氮的吸收和植物生长，解释了AM 真菌和有机质对寄主植物氮素吸收及生长的协同作用。本研究通过在田间试验进一步确证了对菌根化玉米施加有机物料，有利于增加玉米籽粒中磷素和氮素含量，提高了可溶性糖、淀粉、蛋白质和氨基酸含量等产品的品质。