黄芪对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-2、IL-4及其行为学变化的影响*

张 亚 杨 琳 姜荣燕 李然然 李萍萍 陈述英

1.济南市妇幼保健院，山东 济南 250000；2.山东第一医科大学第二附属医院儿内科，山东 泰安 271000

支气管哮喘是儿童常见的气道高反应性慢性炎症，咳嗽和喘息也是呼吸道内气流受阻所引起，这一慢性疾病通常影响儿童的生活质量，直接或间接影响着儿童身体发育水平，及时控制这一疾病刻不容缓[1]。国内外学者从中药和西医治疗方面做了大量动物实验和临床研究，试图寻求更好的防治办法，但最终结果尚未臻善。研究显示，黄芪富含皂苷、多糖、黄酮类等化合物以及多种微量元素，具有调节免疫功能的作用[2]。屏哮饮的主要成分是黄芪，其可以缩短哮喘的治疗疗程[3]，为本实验使用黄芪进行干预并治疗哮喘提供依据。本实验从分子水平研究黄芪治疗哮喘的可能机制，通过对黄芪和激素作用于哮喘小鼠，分别检测IL-2、IL-4在小鼠肺泡灌洗液中的含量。

1 资料与方法

1.1 动物及试剂

由山东大学实验动物中心提供50只重量18～20 g的BALB/c雌性小鼠,年龄6～8周。黄芪颗粒由南京同仁堂药业有限责任公司提供，3 g/袋，相当于黄芪原材料15 g。卵白蛋白(OVA)从美国Sigma公司购得。白介素检测试剂盒从上海赫湃生物科技有限公司购得。

1.2 试剂制备

(1)60%黄芪液制备：将3 g黄芪颗粒倒入5 ml的蒸馏水中并搅拌，保存在4℃的冰箱中；(2)OVA致敏液制备：将4 mgOVA倒入8 ml的生理盐水中并搅拌均匀；(3)2%OVA雾化液：将600 mgOVA倒入30 ml生理盐水中并充分混匀。

1.3 仪器

超声雾化器由德国百瑞有限公司购得，哮喘激发实验使用自制塑料材质箱子(35 cm×25 cm×15cm)。

1.4 动物分组与模型制备

50只小鼠随机平均分为5组，各10只，A组为黄芪干预组、B组为正常对照组、C组为黄芪干预+激素干预组、D组为哮喘模型组、E组为单纯激素干预组。除对照组(B组)外，其余各组(A、C、D、E组)哮喘标本的获取分为致敏和激发两个步骤，分别于第1、8和15天腹腔注射OVA致敏液致敏2ml；其中，A组和C组在OVA致敏液致敏的同时,从第1天起每天给予黄芪液2 ml灌胃，C组和E组从第1天给予腹腔注射1 mg地塞米松。第22天将A、C、D、E组小鼠分别放置于自制箱子内，使用2%卵白蛋白雾化液进行激发45 min,共一周。当小鼠出现躁动不安、深大呼吸、频繁点头动作、腹部抽动加剧、频繁揉鼻等症状时,表示哮喘激发成功。

1.5 支气管肺泡灌洗液的获取

所有小鼠在第30天时被处死，结扎左主支气管，将气管上部剪成一个倾斜面,以0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)反复抽吸后吸取2次,每次0.6ml。将吸取液离心10 min(1000 rpm ),采集上清液并放置于-20 ℃冰箱中。将BALF采用酶联免疫吸附试验法检测IL-2、IL-4含量。

1.6 统计学分析

以上试验数据的统计分析均使用统计软件SPSS23.0，(均数±标准差)来表示正态分析后的IL-2、IL-4含量，差异是否有统计学意义则通过P值与0.01的关系来判断。

2 结 果

2.1 各组小鼠行为学变化

B组小鼠行为无异常。D组小鼠在雾化过程中出现频繁抓耳揉鼻、浅快呼吸动作、前肢缩抬站立、点头动作、咳嗽。卵白蛋白雾化几天后小鼠体重减轻,皮毛干枯。使用黄芪和地塞米松的干预组(即A、C、E组)状况优于哮喘模型组,但未达到正常组小鼠状态。

2.2 各组小鼠BALFIL-2、IL-4浓度

D组小鼠BALF中IL-4的含量高于B组，IL-2的含量低于正常对照组；使用黄芪和激素的三组(A、C、E组)BAL中IL-4的含量低于D组小鼠，IL-2的含量高于D组小鼠。与C组比较，A组、E组小鼠BALFIL-4含量均稍高，IL-2含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；A组与E组比较IL-2含量降低，IL-4含量升高(P<0.01)；见表1。

表1 各组小鼠肺泡灌洗液中IL-2及IL-4含量(pg/ml)

3 讨 论

随着支气管哮喘的新增发病人数及复发人数逐年升高，人们更加重视探究其发病原因及寻求新的治疗方法。近年来的研究结果显示，致病机制目前尚不清楚，但多数学者认为比较使人信服的机制，可能与以Th1/Th2平衡失调所引起的免疫反应有关，其中Th2被认为是可以加速支气管哮喘产生的亚群，另一种辅助T细胞则可以阻止支气管哮喘的发生[4]。有人认为[5-6]Th2细胞是支气管哮喘的基础细胞，这一辅助T细胞可以产IL-4、IL-10等多种炎症因子，不仅可以改变嗜酸性粒细胞、肥大细胞等的数目，还可以使浆细胞产生总IgE增多。这些细胞同时对气道重建也发挥不可替代的作用，在支气管哮喘患者的气管上皮、肺脏和肺泡灌洗液中都可以找到。Th1细胞同样作为辅助性T细胞也在哮喘的发病中起着举足轻重的作用，其可以产生IL-2、IFN-γ等分子。其中IL-2可以参与细胞免疫，其与炎症分子浸润和呼吸道高流速有着密切的联系。哮喘患者气道内Th1有一种叫做主T-bet的转录因子，含量低于健康人群，它的降低会使Th1细胞分泌的IL-2水平下降。

中医药是我国对于哮喘的预防和治疗的亮点所在，有待于更深层面的研究。黄芪入脾经，有补中益气的功能，可以补气养血、治疗疮疡、痈疽，还具有增强免疫功能的作用[7]。国内有研究[8]发现黄芪可以干扰Th1/Th2的表达水平，通过阻碍IL-4产生的方式，达到免疫调节的效果。另有研究[9]证实：黄芪具有增强Th1表达同时减弱Th2功能的作用。黄芪应用于哮喘患者后，会增强FEV1、FEV1%和PEF，由此证实黄芪可以使患者的通气能力改变，使呼吸道高反应性下降[10]。

本实验通过对小鼠肺泡灌洗液中IL-2、IL-4的检测发现：黄芪干预后的哮喘模型中IL-2、IL-4的含量较哮喘模型鼠均出现明显差异。本实验证实了黄芪在哮喘模型中可以抑制炎性因子IL-4，同时增强IL-2的表达，从而平衡哮喘小鼠Th1/Th2的失衡，缓解哮喘的症状。虽然其抗炎效果不如地塞米松，但需要关注的是，中药不仅可以抗感染，而且具有增强免疫反应的作用，同时黄芪还是一种补益类中药，没有激素的副作用，综合评估，总体效应优于单纯使用激素类药物。结果同时显示注射黄芪的小鼠IL-4和IL-2仍高于或低于正常对照组，说明黄芪还不能作为单一用药治疗哮喘；并且同时应用黄芪和激素的E组中两种白介素含量与对照组更接近，也说明了我们可以在以后的治疗中同时应用黄芪和激素治疗，从而更快更好地控制炎症反应，使更多的患儿早日免去支气管哮喘的烦扰。