CD133及CD44在肺癌组织中表达及其与临床病理学特征和预后的关系

唐治蓉，龙琼先，刘欣雅，廖文华，张旭乾

(南充市中心医院 病理科，四川 南充637000)

肺癌是目前病死率占居世界首位的恶性肿瘤，具有发病率、增长率、死亡率高和治愈率低的特点[1]。影像学诊断是肺癌患者选择手术治疗的主要依据，但患者早期发病隐匿，鉴别肺良性病变与肺癌有一定难度，致使错过最佳手术时间而延误治疗，患者五年生存率较低[2,3]。因此，寻找新的治疗靶点以延长肺癌患者总生存期十分重要。肺癌干细胞(lung cancer stem cell，LCSC)是一类可自我更新、无限繁殖以及多向分化进而导致肿瘤形成的特殊细胞亚群，既往研究证实，LCSC可能参与肺癌发生、发展过程，为肺癌临床治疗的研究提供特异性治疗靶点[4,5]。CD133、CD44是两种常见的肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)标志物，参与口腔鳞状细胞癌[6]、结直肠癌[7]、卵巢癌[8]、前列腺癌[9]等多种肿瘤侵袭、转移过程，但二者在肺癌中的联合研究较少。本研究通过免疫组化和Western-Blot方法检测CD133及CD44在肺癌组织中的表达情况，分析CD133及CD44表达与肺癌临床病理特征间的关系，并探讨二者表达情况与肺癌预后的关系，旨在为肺癌靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

募集我院2011年12月至2013年12月收治的经病理确诊的73例肺癌患者病理标本，同时募集对应的病理证实无肿瘤细胞浸润的正常癌旁组织标本61例，即刻冷冻保存。73例肺癌患者中男48例，女25例，年龄31-80岁，平均年龄(67.19±8.42)岁，低分化患者46例，中分化患者22例，高分化患者5例，淋巴结远处转移40例，无淋巴结远处转移33例。纳入标准：①病理确诊为肺癌；②初治患者；③未合并肺部其它疾病。排除标准：①合并其它部位原发性肿瘤患者；②接受放化疗治疗；③伴有慢性感染性疾病患者；④妊娠或哺乳期女性。

1.2 方法

1.2.1免疫组化染色 石蜡包埋的标本切片固定后脱腊水化，加入H2O2室温孵育15 min。用PBS漂洗3次，共3 min，滴加5%BSA封闭1h，甩掉液体。加入一抗(CD133、CD44)后4℃冰箱过夜。PBS漂洗，甩干加入二抗，室温孵育25 min，PBS冲洗，加入DAB染色，苏木精对比染色1 min，脱水、透明、固定。结果判定：出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，CD133、CD44阳性为细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒，随机选取5个视野计算阳性细胞数量，阳性细胞数占视野细胞总数的百分比×细胞着色深浅评分≥4分为阳性。

1.2.2Western-Blot检测CD133及CD44蛋白表达

对73例肺癌组织标本和对应的61例癌旁组织标本进行蛋白提取，称取50 mg组织样品，加入液氮碾碎，再加入500 μl裂解液，2 000 g/min离心1 min，冰浴30 min，4℃离心机2 000 g/min离心15 min，取上清。用BCA法测定蛋白含量，进行蛋白定量。取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳。进行转膜、封闭、杂交，X线下显影、成像。以检测到清晰的条带为有表达，记为“+”，无表达记为“-”，对应的癌旁组织为对照。

1.3 随访情况

门诊方式随访5年，截止日期2018年12月，第1年每3个月随访一次，之后每6个月随访1次，记录肺癌患者总生存率和中位生存时间。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计数资料用百分比(n，%)表示，比较用χ2检验；生存分析用Kaplan-Meier法，生存率比较用Log-rank检验，以(%)表示，P<0.05说明有统计学差异。

2 结果

2.1 肺癌和对应癌旁组织中CD133及CD44免疫组化染色情况比较

CD133、CD44既表达于肺癌组织，也表达于对应癌旁组织，在肺癌组织中主要表达于肿瘤细胞质，阳性细胞呈棕黄色颗粒分布，CD133在肺癌组织中阳性表达率为60.27%(44/73)，在癌旁组织中阳性表达率为8.20%(5/61)，差异有统计学意义(χ2=38.85，P<0.05)；CD44在肺癌组织中阳性表达率为65.75%(48/73)，在癌旁组织中阳性表达率为11.48%(7/61)，差异有统计学意义(χ2=40.46，P<0.05)。见图1。

图1 肺癌和对应癌旁组织中CD133及CD44免疫组化染色情况比较

2.2 肺癌和对应癌旁组织中CD133及CD44蛋白表达情况比较

肺癌组织中CD133、CD44蛋白表达水平明显高于对应癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肺癌和对应癌旁组织中CD133及CD44蛋白表达情况比较[n(%)]

2.3 肺癌组织中CD133及CD44表达水平与临床病理特征比较

鳞癌患者CD44表达水平明显高于腺癌、小细胞癌患者(P<0.05)，发生淋巴结远处转移肺癌患者CD133及CD44表达水平明显高于未发生淋巴结远处转移患者(P<0.05)，CD133表达水平与肺癌患者性别、年龄、临床TNM分期、肿瘤直径、病理类型、分化程度无关(P>0.05)，CD44表达水平与肺癌患者性别、年龄、临床TNM分期、肿瘤直径、分化程度无关(P>0.05)。见表2。

2.4 CD133及CD44表达与肺癌患者预后关系

CD133、CD44阳性患者与CD133、CD44阴性患者生存情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，见图2。

3 讨论

正常情况下，细胞自我更新调控受到严格的程序性控制，一旦发生恶性转化后，将破坏细胞自我更新调控机制平衡，另外，由于CSC具有自我更新、促使肿瘤形成以及维持肿瘤存在的特点，使得肿瘤产生异质性，最终使得以手术为主的综合治疗预后欠佳[10,11]。因此，学者们认为针对CSC进行治疗可能为肿瘤治疗开辟新的途径。LCSC是肺癌组织内具有干细胞特性的细胞，在肺癌发生、转移过程中发挥关键作用[12]。既往报道表明，CSC标志物CD133、CD44可能对肺癌生物学特征以及患者预后有着重要影响[13]。

CD133是一种跨膜糖蛋白，广泛表达于造血干细胞、内皮祖细胞以及各种正常组织干细胞中[14]。Wang等[15]报道指出，喉鳞状细胞癌细胞株Hep2和TU-177中分离出的CD133+CD44+细胞群具有较高的细胞存活率以及较强的迁徙、转移和集落形成能力，对顺铂和辐射具有较强的耐药性，CD133+CD44+CSC有望成为喉鳞状细胞癌抗肿瘤药物和治疗策略的新靶点。刘鑫等[16]研究证实，肺腺癌患者外周血CD133表达与区域淋巴结转移有关，其阳性表达率为66.9%，可用于评估肺腺癌患者预后。本研究结果显示，CD133在肺癌组织中的阳性表达率60.27%显著高于对应癌旁组织的8.20%，其表达与肺癌患者淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、临床TNM分期、肿瘤直径、病理类型、分化程度无关，且其在发生淋巴结远处转移肺癌组织中表达水平明显高于未发生淋巴结远处转移组织，表明CD133可能作为肺癌淋巴结转移的预测指标，在肺癌进展过程中发挥作用，与既往报道相符。Kaplan-Meier生存分析结果显示，CD133阳性患者生存率明显低于阴性患者，表明CD133可能影响肺癌患者预后，且其高水平表达提示患者不良预后。

表2 肺癌组织中CD133及CD44表达水平与临床病理特征比较[n(%)]

表3 CD133及CD44表达与肺癌患者预后关系

图2 CD133及CD44表达与肺癌患者预后关系

CD44可促进细胞与细胞和细胞-基质间的相互作用，并参与细胞粘附和生长因子在细胞表面组装[17]。蔡传书等[18]研究发现，CD44在非小细胞肺癌组织中过量表达，且其阳性表达率越高，肿瘤细胞分化程度越低，提示CD44异常表达与非小细胞肺癌发病有关。本文研究结果显示，CD44在肺癌组织中的阳性表达率65.75%显著高于对应癌旁组织的11.48%，其表达与肺癌患者病理类型、淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、临床TNM分期、肿瘤直径、分化程度无关，且其在鳞癌组织中表达水平明显高于腺癌、小细胞癌组织，在发生淋巴结远处转移肺癌组织中表达水平明显高于未发生淋巴结远处转移组织，可能与CD44在上皮中高水平表达有关，表明CD44与肺癌病理类型以及恶性程度紧密联系。进一步Kaplan-Meier生存分析结果显示，CD44阳性患者生存率明显低于阴性患者。以上结果表明，其可能推动肺癌发生、发展进程，最终影响肺癌患者预后。越来越多报道显示，CD133及CD44高表达细胞在体外具有较高侵袭能力、转移能力，可通过影响肿瘤细胞增殖、转移过程推动肿瘤发展进程，进而影响肿瘤疾病转归[19,20]。

综上所述，CD133及CD44与肺癌发生、发展密切联系，二者高水平表达可能指示患者不良预后，有助于深入理解肺癌肿瘤侵袭、转移分子机制，对寻找新的肺癌治疗靶点、预后评估有一定的参考价值，值得学者后续研究探索。