丹皮酚对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的影响

赵俊云，杨向竹，郭健

(北京中医药大学，北京 102488)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以全身关节滑膜异常增生及炎症为主要表现的系统性自身免疫疾病[1]，其中滑膜异常增生主要与滑膜成纤维细胞的类肿瘤细胞的异常增殖及异常分泌表型有关，在RA发生发展中异常活化的滑膜成纤维细胞起着至关重要的作用，其通过分泌炎症介质进一步导致滑膜炎症和软骨损伤，因此成为抗RA药物的重要靶细胞之一[2]。临床上RA治疗多采用糖皮质激素、非甾类抗炎药、免疫抑制剂或靶向生物制剂等[3]，副作用和不良反应多，或价格昂贵，难以长期使用。因此，高效、低副作用一直是抗RA药物研究的主要问题。植物药，如雷公藤、白芍、青藤等来源的活性成分已被应用于RA治疗的研究，显示一定的疗效，但也常伴随毒副作用的出现[4]。丹皮酚是中药牡丹(Paeonia suffruticosa)干燥根皮的主要活性成分,课题组前期工作显示丹皮酚有较好的抗炎和抑制肿瘤细胞增殖的活性[5]。本研究旨在探讨丹皮酚在体外对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的影响，为丹皮酚及其衍生物用于治疗类风湿关节炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

丹皮酚(Paeonol, PAE)购自国家食品药品检定所(no.100447-200701),纯度98%； DMEM medium、Fetal Bovine Serum、0.25% Trypsin-EDTA购自Invitrogen; Annexin V-PI Apoptosis Detection Kit购自BD Biosciences；PureLinkTMRNA Mini Kit、TaqManTMGene Expression Master Mix购自Thermo Fisher Scientific；HPRT、Ki-67、Caspase-3 Taqman引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；Anti-human Ki-67 antibody、Anti-human Caspase-3 antibody购自Cell Signal Technology；人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞株MH7A购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖

按常规方法[5]培养MH7A细胞，使用0.05%胰蛋白酶溶液消化3 min，终止消化后收集细胞，以每孔约4×104个细胞密度接种于96孔细胞培养板中，培养24 h后，除对照组外，丹皮酚各剂量组分别加入丹皮酚至终浓度为10-6M、5×10-6M、10-5M，每组设5复孔，等体积DMSO处理作为对照组，总体积均为200 μL。分别于培养24 h、48 h、72 h后加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，孵育4～6 h后，每孔吸弃上清液100 μL，每孔加入150 μL DMSO，避光混匀15 min，酶标仪检测OD570，计算抑制率。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

同上制备细胞悬液，以每孔约2×105个细胞密度接种于6孔细胞培养板，培养24 h后，除对照组外，丹皮酚各剂量组分别加入丹皮酚至终浓度为10-6M、5×10-6M、10-5M，每组设3复孔，等体积DMSO处理作为对照组，培养72 h后收集细胞，PBS洗涤，以每毫升约5×106个细胞密度重悬于结合缓冲液，每100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V，避光孵育后，加入2 mL结合缓冲液，离心收集细胞，将细胞重悬于200 μL结合缓冲液，加入5 μL PI溶液，孵育15 min，上机分析，计算凋亡细胞比例。

1.2.3 qRT-PCR检测

同上接种细胞和分组给药处理，培养72 h后收集细胞，按试剂盒说明提取mRNA，检测浓度和纯度，依次进行逆转录和real-time PCR。

1.2.4 Western blot检测

同上接种细胞和分组给药处理，培养72 h后收集细胞，加裂解液处理，离心提取总蛋白，定量后进行SDS-PAGE电泳，使用PVDF膜进行转移电泳，5%封闭液处理1 h后，分别加入稀释后的Anti-human Ki-67 antibody和Anti-human Caspase-3 antibody，孵育过夜，β-actin作为内参抗体，洗膜后，加入稀释后的二抗，孵育1 h，曝光显影。

1.2.5 数据处理

2 结果

2.1 丹皮酚对MH7A细胞增殖的影响

MTT实验结果显示，丹皮酚各剂量处理对MH7A细胞的增殖均有明显抑制作用，见表1。

表1 丹皮酚抑制MH7A的增殖(%)

2.2 丹皮酚对MH7A细胞凋亡的影响

根据细胞增殖实验结果，使用丹皮酚处理细胞72 h后，用流式细胞术结合双染法测定凋亡信号，发现丹皮酚各剂量组凋亡细胞比例显著增加(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 丹皮酚促进MH7A凋亡(%)

注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

2.3 丹皮酚对Ki-67、Caspase-3 mRNA水平的影响

qRT-PCR结果显示，各剂量丹皮酚处理细胞72 h后，Ki-67转录水平显著降低(P<0.01)，高剂量组Caspase-3转录水平显著升高(P<0.05)，见图1。

2.4 丹皮酚对Ki-67、Caspase-3蛋白水平的影响

各剂量丹皮酚处理MH7A细胞72 h后，Ki-67蛋白水平显著降低，Caspase-3蛋白水平显著升高，见图2。

注:CTRL：对照组；PAE-L：丹皮酚低剂量组；PAE-M：丹皮酚中剂量组；PAE-H：丹皮酚高剂量组；与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01图1 Ki-67和Caspase-3 的mRNA水平

注:CTRL：对照组；PAE-L：丹皮酚低剂量组；PAE-M：丹皮酚中剂量组；PAE-H：丹皮酚高剂量组；与对照组比较，**P<0.01图2 Ki67和Caspase-3 的蛋白水平

3 讨论

RA患者关节滑膜成纤维细胞的增长和死亡失衡是造成滑膜增生和关节炎症的主要原因[6]，因此,如何有效抑制滑膜成纤维细胞的增殖与促进其凋亡是抗RA药物研究的重要方向之一。由于RA滑膜成纤维细胞有类似于肿瘤细胞的某些表型，如能在氧化应激条件下自主生存[7]，且RA患者关节的微环境也类似于低氧、低营养的肿瘤微环境，提示对肿瘤细胞增殖和凋亡有影响的药物可能对滑膜成纤维细胞的增殖和凋亡具有相似作用。

本研究中使用MTT法检测到丹皮酚对MH7A的体外增殖有抑制作用，且抑制率与剂量及作用时长呈正相关，丹皮酚中剂量组作用72 h可达到接近50%的抑制率，这显示丹皮酚具有长时间用药的可能性，可根据情况调整为适当剂量。使用流式细胞术结合双染法检测到丹皮酚各剂量组的凋亡细胞比例较对照组均显著升高，且凋亡细胞比例随着药物浓度的增加而升高，推测丹皮酚可促进MH7A发生凋亡。

为了进一步明确丹皮酚抑制增殖与诱导凋亡的可能机制，对丹皮酚处理后的细胞进行增殖标记物Ki67和重要凋亡基因Caspase-3的表达情况观察。Ki-67(Cell proliferation-associated nuclear antigen Ki67)是一种细胞增殖必需的核蛋白，被用作细胞增殖标记物，常用于肿瘤分级鉴定[8]。本研究使用Ki-67作为主要指标来表示MH7A的增殖状态。Caspase-3蛋白是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族中的一员，其外源性激活将触发细胞凋亡途径，在细胞凋亡中起主导作用[9]。本研究使用Caspase-3作为主要指标来表示MH7A的凋亡水平。

本研究中使用qRT-PCR法检测到丹皮酚处理72 h后，各剂量组Ki-67的mRNA水平均显著降低，且高剂量组下降幅度最大，与MTT实验结果基本一致。而Caspase-3的mRNA水平仅高剂量组有明显升高，低中剂量组变化并不明显，推测丹皮酚诱导MH7A凋亡可能存在着阈值效应。使用Westernblot法检测到丹皮酚处理72 h后，各剂量组均出现Ki-67蛋白水平显著降低，Caspase-3蛋白水平显著升高，其中Ki-67的组间差异与MTT实验结果保持一致，Caspase-3的组间差异并不明显，进一步提示丹皮酚诱导MH7A凋亡的剂量阈值效应。总体上看，丹皮酚在低剂量使用时即可达到抑制增殖和诱导凋亡的效果，这为长期维持用药提供了可能性。

综上，丹皮酚是有效的滑膜成纤维细胞体外生长的调节剂，结合其抗炎活性，有望用于RA的临床治疗，后续研究将以低毒性为目标进一步探讨其衍生物的开发及适用剂型的研究。