基于线粒体DNA控制区序列的团头鲂3个选育群体遗传变异分析

唐首杰 毕详 张飞明 张友良

摘要：为从遗传多样性的角度来了解团头鲂3个选育群体的选育潜力，以团头鲂浦江1号选育奠基群体（F0）为对照组，采用线粒体DNA控制区标记评估团头鲂3个选育群体的遗传多样性，分析它们的选育潜力。结果显示，在3个选育群体的72条序列中共确定40种单倍型，群体间存在5种共享单倍型，3个选育群体线粒体DNA控制区序列的单倍型多样性（H）范围为0.670～0.978，核苷酸多样性（π）范围为0.004 16～0.006 23，平均核苷酸差异数（K）范围为3.935～5.960，群体内核苷酸序列间平均遗传距离范围为0.003 561～0.004 538，3个选育群体的遗传多样性水平（H、π、K）略高于F0群体。3个选育群体间Kimura双参数遗传距离和遗传分化指数（FST）范围分别为0.004 039～0.004 700 和0.046 4～0.138 6。3个选育群体间成对FST值差异均显著（P<0.05），3个选育群体与F0群体间成对FST值差异均极显著（P<0.01）。说明3个选育群体的遗传多样性较高，选育潜力较大;同时，选育群体间均存在显著的遗传分化，可见不同方向上的累代人工选育已在一定程度上改变了选育群体的遗传结构。

关键词：团头鲂;选育群体;遗传变异;线粒体DNA;遗传多样性

中图分类号： S931.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0191-05

在鱼类育种过程中，维持鱼类选育群体遗传多样性，一方面可提高选育群体对环境的适应能力和对疾病的抵抗力[1]，另一方面足够的遗传变异水平对保持长期选育过程中的选择反应具有重要作用[2]。在实际的鱼类选育工作中，育种工作者通常采用科学合理的方案对鱼类的重要经济性状进行有计划、有目的的选择，如保持足够大的亲本群体、创造适宜的养殖环境等。然而，选育条件下鱼类的繁殖多是在人工控制条件下进行的，在进行人工繁殖的过程中，亲本对的选择不可能是完全随机的，因此，封闭的选育群体仍可能受到非随机交配、遗传漂变等因素的影响，从而导致遗传多样性的下降和稀有等位基因的喪失，并进一步增加近交衰退的风险[3]。近年来许多研究显示，累代人工选育致使鱼类选育群体遗传多样性逐代降低[4-5]。Gallardo等的研究表明，银大马哈鱼（Oncorhynchus kisutch）经连续4代人工选育后，选育群体近交率高达9.5%，平均每代近交率约为2.45%，近交导致选育群体繁殖力显著下降[6]。因此，在长期的鱼类选育过程中，及时监测选育群体内遗传变异水平，保持选育群体的遗传多样性，是长期选育工作获得最终成功的保证[7-8]。

团头鲂浦江1号是经16年6代高强度系统选育而成的首例草食性鱼类选育良种[9]。自浦江1号审定以来，上海海洋大学水产种质资源研究室坚持继续选育，至今已达第10代（F10）。鉴于没有永远的良种这一理念和推陈出新的时代要求，笔者所在研究室在浦江1号良种（F10）的基础上，基于配套系育种理念[10]，以不同选育目标分别建立3个团头鲂配套选育系，并对这3个配套育种群体进行连续多代的选育纯化，而连续世代的选育对选育群体遗传多样性影响程度、3个选育群体是否存在继续选育的潜力，至今尚未有精确的遗传检测手段来进行定量评估。

鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、结构简单、进化速度快、遵从母系遗传等特点[11]，而mtDNA控制区是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域，已被成功应用于褐鳟（Salmo trutta）[12]、鲤（Cyprinus carpio L.）[13]、红大马哈鱼（Oncorhynchus nerka）[14]等养殖鱼类种群遗传多样性的检测和评估。

本研究以团头鲂浦江1号选育奠基群体（F0）为对照组，通过mtDNA控制区序列变异来评估团头鲂3个选育群体的遗传多样性和遗传结构，分析它们的选育潜力，为选育群体遗传性能的保护提供依据，并为下一步配套系选育工作提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

对照组为团头鲂浦江1号选育奠基群体（F0），系1985年淤泥湖团头鲂原种在上海海洋大学鱼类种质研究试验站自繁的后代;试验组为3个团头鲂选育群体，其来源和性质如下：（1）选育群体A（以下简称A），团头鲂浦江1号选育系F10;（2）选育群体B（以下简称B），以人工诱导异源四倍体群体（团头鲂浦江1号♀×三角鲂[XZ（20#]♂[XZ）]）[15]为奠基群体，经群体选育的第3代（F3）;（3）选育群体C（以下简称C），以团头鲂连续2代人工诱导减数分裂雌核发育群体[16]为奠基群体，经群体选育的第3代（F3）。对照组群体采自上海海洋大学鱼类种质研究试验站，试验组群体均采自上海市松江区水产良种场。群体A、群体B和群体C的采样数均为24尾，F0群体采样12尾，剪取每尾试验鱼的尾鳍，编号后于95%乙醇中保存备用。前期采样工作于2017年1月完成，后续实验室分析工作于2017年7—9月在上海海洋大学淡水水产种质资源重点实验室完成。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取

基因组DNA提取采用常规的酚/三氯甲烷法[17]进行。

1.2.2 线粒体DNA控制区引物设计

团头鲂线粒体DNA控制区（D-loop区）位于转脯氨酸（tRNA-Pro）基因和转苯丙氨酸（tRNA-Phe）基因之间，根据GenBank中已报道的团头鲂线粒体DNA全序列（登录号为NC_010341.1），利用在线引物设计软件Primer3[18]设计D-loop区的正向引物和反向引物。引物序列及退火温度见表1。所有引物均由生工生物工程（上海）技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增及检测

PCR扩增反应在Eppendorf Mastercycler gradient PCR仪上进行，样品的反应总体积为 50 μL，包括正向引物2.5 μL（5 μmol/L）、反向引物2.5 μL（5 μmol/L）、2×PCR Reagent 25 μL、DNA模板1 μL、无菌水19 μL;PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56.4 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。

取2 μL扩增产物经1.5%进口分子生物学级琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL EB）电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为 5 V/cm，经1.5 h后，用Gene Genius凝胶成像系统拍照、记录和分析。

1.2.4 DNA序列测定

所有样品委托生工生物工程（上海）技术服务有限公司进行纯化和单向测序，测序引物为控制区的正向引物（F），序列测定仪为美国ABI公司PRISM 3730型全自动序列分析仪。

1.3 数据处理和分析

用BLAST软件[19]搜索GenBank中团头鲂（Megalobrama amblycephala ，序列登录号为NC_010341.1）的线粒体DNA控制区序列，与本试验测得的团头鲂相应序列结果进行同源性比较;然后用BioEdit软件[20]对测序结果进行编辑，用Clustal W软件[21]进行序列重排和同源比较，并进行人工核对校正。用DNAsp 4.10软件[22]计算多态位点数、单倍型多样性（haplotype diversity，H）[23]、核苷酸多样性（nucleotide diversity，π）[24]和平均核苷酸差异数（average number of nucleotide differences，K），序列变异中性检验（neutrality test）用Tajima的D统计检验[25]。单倍型多样性（H）和核苷酸多样性（π）计算公式如下：

式中：n为群體样本大小;pi为第i个单倍型在群体中出现的频率;k为单倍型数目;xij为第i个核苷酸（A、G、C或T）在序列中的第j位点上的频率;L为序列的长度。

用Arlequin 3.01软件[26]估测群体间成对FST值[27]，并利用置换检验法进行显著性检验（重复次数为1 000）。

采用分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）估算各群体间和群体内的遗传变异及分化水平。通过3种分子遗传变量进行分析：FST为群体内个体之间的遗传变异;FSC为组内各群体间的变异程度;FCT为不同组别之间的遗传变异程度。并用置换检验法进行1 000次重复模拟计算，以上运算在Arlequin 3.01软件[26]中完成。

用MEGA 4.0软件包[28]根据Kimura Two-Parameter法[29]计算群体内和群体间核苷酸序列的两两间遗传距离，用非加权配对算术平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）和邻接法（neighbour-joining method，NJ）构建群体间的分子系统树（kimura two-parameter法估算遗传距离）。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物序列测定及排序结果

4个团头鲂群体共84个个体的线粒体DNA控制区片段的PCR扩增产物经纯化后测序，各扩增片段经同源重排后的长度（不包括插入/缺失）为962 bp。

2.2 4个团头鲂群体的遗传结构

2.2.1 群体内遗传多样性分析

4个团头鲂群体内的单倍型分布及频率见表2。在所分析的84条序列中，确定了46种单倍型，F0群体与其他3个选育群体间无共享单倍型，3个选育群体间存在5种共享单倍型，其中单倍型H1为A群体、B群体和C群体所共享，单倍型H10为A群体和C群体所共享，单倍型H13、H17和H18为B群体和C群体所共享。F0群体中出现频率最高的单倍型为H41，H1分别为A群体、B群体和C群体中出现频率最高的单倍型。

4个团头鲂群体内的遗传多样性参数见表3。各群体内单倍型数范围为6～19，其中C群体的单倍型数最多，F0群体的单倍型数最少。4个团头鲂群体内线粒体DNA控制区的单倍型多样性（H）在0.670～0.978之间，其中C群体的单倍型多样性最高，A群体的单倍型多样性最低，单倍型多样性在4个群体中的变化趋势由高到低依次为C群体>B群体>F0群体>A群体。

4个团头鲂群体内线粒体DNA控制区核苷酸多态位点数在11～22之间，核苷酸多样性（π）在0.00267～0.00623之间，平均核苷酸差异数（K）的范围为2.485～5.960;群体内个体间平均核苷酸差异数和核苷酸多样性在4个群体中的变化趋势一致，即C群体>B群体>A群体>F0群体。A群体的多态位点数最多（22个），F0群体的多态位点数最少（11个）。3个团头鲂选育群体Tajima's D中性检验均不显著，符合中性突变。

总体而言，C群体遗传多样性水平最高，F0群体遗传多样性水平最低，3个团头鲂选育群体遗传多样性水平高于F0群体。

2.2.2 群体间遗传距离和遗传分化

如表4所示，4个团头鲂群体内线粒体DNA控制区核苷酸序列间的平均遗传距离在0.002 526～0.004 538之间，在4个群体间的变化趋势为C群体>B群体>A群体>F0群体，这与上文中的核苷酸多样性（π）、平均核苷酸差异数（K）的分析结果一致。

4个团头鲂群体间的平均遗传距离在0.004 039～0.006 140 之间，F0群体与C群体间的遗传距离最大，为 0.006 140，A群体与B群体间的遗传距离最小，为 0.004 039。对于3个选育群体而言，A群体与C群体间遗传距离最大，为0.004 700。

如表5所示，群体间的遗传分化指数（FST）在0.046 4～0.396 7之间，F0群体与C群体之间的遗传分化指数最高，为0.396 7，B群体与C群体之间的遗传分化指数最低，为 0.046 4。从群体间显著分化的P值（0.000 0～0.036 0）可以推断，群体间成对FST值差异均显著（P<0.05），表明所有群体间均存在显著的遗传分化。

2.2.3 分子方差分析（AMOVA）

本研究对4个团头鲂群体进行分组（1个组、2个组、3个组），从不同角度对群体遗传变异进行分子方差分析（AMOVA）。结果（表6）显示，在任何一种分组条件下，FST值都达到了极显著水平（P<0.01），说明群体内个体间的遗传分化极显著。当把所有群体分成2个组或3个组时，FSC值均达到显著（P<0.05）或极显著水平（P<0.01），表明群体间存在显著或极显著的遗传分化，这证实了群体间遗传分化指数（FST值）的分析结果。将4个群体分成2个组时，4个群体在2种分组模式下（模式1：F0群体为一组，其余群体为另一组;模式2：F0群体和A群体为一组，B群体和C群体为另一组），FCT值达到了极显著水平（P<0.01），表明组别之间存在极显著的遗传分化。将4个群体分成3个组时，仅在1种分组模式下（F0群体为第1组，A群体为第2组，B群体和C群体为第3组），FCT值达到显著水平（P<0.05）。此外，在其他分组模式下，FCT值均未达到显著水平。

2.2.4 聚类分析

如图1所示，因聚类方法的差异，2种聚类图显示了各自的特点，很难说哪种聚类图最能反映真实的群体间遗传关系，但2种聚类图均显示，B群体和C群体可被聚为一类，F0群体和B群体间聚类关系较远，这也验证了上文中分子方差分析的结果。

3 讨论与结论

3.1 团头鲂3个选育群体的遗传多样性分析

遺传多样性是鱼类育种群体具有选育潜力的物质基础，只有保持选育群体的遗传多样性，才能获得持续的遗传进展，从而保证鱼类选育工作的可持续开展。线粒体DNA标记是评价鱼类群体遗传多样性水平的有效工具之一[30]，以线粒体DNA序列变异为基础估算的单倍型多样性、核苷酸多样性等参数是衡量群体遗传多样性的重要参数。单倍型多样性是指从样本中随机抽取到2个不同单倍型的频率[23]，单倍型多样性越高，说明群体内遗传多样性水平越高。Nei等将核苷酸多样性定义为给定群体中随机选取的DNA序列间平均每个位点的核苷酸差异数目，其值越大，表明群体内的遗传多样性越高[24]。

在本研究中，3个选育群体的单倍型多样性为0.670～0.978（平均值为0.869 3），核苷酸多样性为0.004 16～0.006 23（平均值为0.005 06），均略高于F0群体，说明长期的选育并未显著影响选育群体的遗传多样性。这与其他鱼类选育群体遗传多样性研究结果不同[4-5]，已有的研究结果显示，连续多代选育群体的遗传多样性水平低于选育奠基群体[4]或野生对照群体[5]。而在本研究中，F0群体在累代的自繁过程中，可能因随机遗传漂变的作用而造成群体内近交程度不断增加，最终导致群体遗传多样性下降。进一步将本研究中的3个选育群体遗传多样性结果与国内外其他鱼类选育群体的线粒体DNA遗传多样性研究结果比较后可以发现，本研究中3个选育群体的遗传多样性参数（单倍型多样性、核苷酸多样性）均高于草鱼（Ctenopharyngodon idella）[5]、松浦鲤（C. carpio ‘Songpu Carp）[31]、奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）[32]、褐鳟（Salmo trutta）[12]、鲤（C. carpio L.）[13]、红大马哈鱼（Oncorhynchus nerka）[14]等鱼类的选育群体的相应参数。综上所述，本研究中的3个团头鲂选育群体历经多代选育后仍保持着较高水平的遗传多样性，对其进行进一步的选育纯化和种质资源聚合利用的潜力较大。

3.2 团头鲂3个选育群体间的遗传分化

遗传分化在本质上是基因频率的概率变化及其杂合性变化的度量[33]，而人工定向选育通过改变群体的基因频率来促使遗传分化的产生。遗传分化指数（FST）常用于度量群体间遗传分化的相对大小，其数值越大，表明2个群体间的遗传分化水平越高。本研究中，3个选育群体间遗传分化指数（FST）为0.046 4～0.138 6，显著性检验结果均显示（P<0.05），群体间遗传分化已达显著水平，此外，选育奠基群体F0与3个选育群体间的遗传分化指数（FST）为0.257 2～0.396 7，显著性检验结果也显示，3个选育群体与F0群体间遗传分化已达极显著水平（P<0.01）。以上结果表明，不同方向上的累代人工选育在一定程度上改变了选育群体的遗传结构，使之产生了不同方向的变化，而这种现象正是育种工作者希望看到的结果，因为通过连续多代的选育纯化，可以使选育群体遗传结构逐步趋向稳定，为配套系育种提供优异亲本。

3.3 选育群体间种质资源聚合利用探讨

杂种优势利用是鱼类配套系育种的重要课题之一，也是鱼类优异种质资源聚合利用的基础，准确预测杂种优势对加快配套系选育进程具有重要意义。一般而言，杂种优势大小与相互杂交的2个亲本群体间的遗传差异直接相关。亲本群体之间的遗传差异越大，杂交后代就越可能获得杂种优势。亲本群体之间的遗传距离是衡量亲本间遗传差异的一个重要指标，遗传距离越大，杂交后代的杂种优势就越强[34]。在本研究中，对于3个选育群体而言，群体间Kimura双参数遗传距离显示，A群体与C群体间遗传距离最大，为0.004 700，A群体和B群体间的遗传距离最小，为0.004 039。由此可以预测，A群体与C群体进行群体间杂交可能获得较明显的杂种优势，然而A群体和B群体间杂交后代的杂种优势可能较小。以上结果为团头鲂选育群体优异种质资源的聚合利用提供了参考。

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