金属硫蛋白1M在非小细胞肺癌中的表达及其与患者预后的关系

徐振雷，张正卫

肺癌是恶性程度很高的肿瘤，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的80%，由于早期症状不明显，约75%的NSCLC患者被确诊时有局部转移或远处转移[1-4]，预后不容乐观，因此寻找新的诊断和治疗标志物迫在眉睫。

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类相对分子量低(6 000～7 000 Da)、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，之前有研究报道其与细胞的金属的代谢有关，并且可以保护细胞免受亲电性致癌物的攻击[5]。越来越多的研究报道MT家族在包括肿瘤在内的病理过程中起到重要调节作用，MT被许多研究团队证明在肝癌中低表达[6]，金属硫蛋白1M(metallothio-nein 1M，MT1M)属于MT家族的一员，有报道MT1M抑制了肝癌的发生发展[7-9]，MT1M启动子甲基化是乳腺癌和肝癌的生物标志物[10-11]，提示MT1M与肿瘤的发生发展密切相关。但是MT1M在NSCLC中的表达及生物学效应尚不完全清楚，本研究采用免疫组织化学方法检测MT1M在NSCLC组织中的表达并分析其与患者临床病理参数及预后之间的关系，并且在体外细胞功能层面研究MT1M与肿瘤侵袭和迁移的关系。

1 资料与方法

1.1 资料 组织芯片购于上海芯超有限公司，包含144对NSCLC组织及对应癌旁组织的组织芯片以及完整的临床病理资料，患者术前均未经放射治疗和化学治疗。

1.2 主要仪器与试剂 GTVisionTM抗兔鼠通用型免疫组织化学试剂盒购自于上海研卉生物有限公司，鼠抗人MT1M抗体、GAPDH单抗、FLAG抗体和兔抗鼠二抗购自于美国西格玛公司。人NSCLC细胞系A549、H520和H1650细胞株，过表达MT1M质粒为PCDH-Lenti-MT1M flag(lenti-MT1M)，2个敲减MT1M质粒为pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-1(shMT1M-1)和pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-2(shMT1M-2)购自于上海中科院研究所。Transwell侵袭和迁移试剂盒购自于美国康宁公司。

1.3 免疫组织化学检测 将组织芯片放置于二甲苯中脱蜡，并在梯度乙醇中水合，在沸腾的柠檬酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH6.0)进行抗原修复15 min，冷却至室温。为了阻断内源性过氧化物酶活性，将芯片浸入0.3%过氧化氢磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中10 min，然后在PBS中充分冲洗。将芯片与MT1M的一抗(1∶100稀释)一起孵育4 ℃过夜。用PBS洗涤后，使用二抗在37 ℃孵育30 min，使用PBS代替一抗作为阴性对照，使用奥林巴斯显微镜和软件成像系统捕获芯片图像。

1.4 免疫组织化学结果判定 将组织芯片在光镜下观察和评分[12]，同时进行病理图像采集。MT1M主要定位在细胞质，综合低倍镜下染色强度和高倍镜下阳性细胞百分比进行半定量测定，为了减少误差，随机选取5个视野进行判读。染色强度评分标准：基本不着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。阳性细胞数百分比评分标准：计数400个细胞，阳性细胞百分数<10%为0分；10%～40%为1分；41%～70%为2分；>70%为3分。两者相加后若为0～2分为阴性；2～6分为阳性。结果由2名有资质的病理科医师进行判读，阴阳性判断不一致时，以第3位病理科医师的判读结果为准。

1.5 稳定表达细胞株的构建 在6孔板内加入适量细胞，使细胞密度24 h后达到50%，使用10%培养基与病毒感染液1:1混合后培养24 h，弃去原培养液，加入1∶2 000嘌呤霉素培养基，筛选出阳性细胞，细胞传代至第三代，收集细胞用免疫印迹法检测过表达和敲减效率。

1.6 Transwell实验分析细胞迁移和侵袭 调整细胞密度至5×105/mL，取200 μL细胞株各约1×105左右的细胞悬匀后铺在上层小室里，下层小室加600 μL含20%胎牛血清的培养基，孵育24 h，吸去上层小室培养液，用PBS清洗2次，用棉签小心刮除小室上方的细胞，反面的细胞用PBS清洗后，用甲醇固定30 min，0.2%的结晶紫染色20 min，PBS清洗后，在高倍镜下(×400)用光镜拍照，每个小室取5个视野，重复3次，计算3次均数。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件，计量资料组间比较采用独立样本t检验、单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05为差异比较具有统计学意义。

2 结果

2.1 MT1M在NSCLC组织中的表达及其与患者临床病理参数间的关系 通过检测144对NSCLC组织及其癌旁组织中MT1M的表达，肿瘤组织中MT1M阳性率为20.14%，癌旁组织中MT1M阳性率为90.28%，肿瘤组织及其癌旁组织之间MT1M阳性表达率差异比较具有统计学意义(χ2=143.23，P<0.01)。肿瘤组织中MT1M表达低于对应癌旁组织。典型免疫组织化学结果见图1。肿瘤组织中MT1M的表达与淋巴结转移、TNM分期有关(χ2分别为18.66、12.73，P均<0.01)，而与性别、年龄、肿瘤直径及分化程度无关(χ2分别为0.001、1.91、0.10、1.80，P均>0.05)，见表1。

MT1M主要定位于细胞质中；A、B为癌旁组织中MT1M高表达；C、D为肿瘤组织中MT1M低表达图1 MT1M在NSCLC组织及其癌旁组织中的表达

表1 MT1M表达与NSCLC患者临床病理参数之间的关系

2.2 MT1M对NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响 通过免疫印迹法检测NSCLC细胞系中MT1M的表达，A549细胞和H520细胞中MT1M表达较正常肺上皮细胞BEAS-2B低，而H1650细胞中MT1M表达高(F=91.21，P<0.01)，图2A。选取A549细胞和H1650细胞用于细胞迁移和侵袭功能实验，在A549细胞中稳定过表达MT1M，在H1650细胞中稳定敲减MT1M，采用免疫印迹法验证不同稳转细胞株中MT1M的表达情况，结果见图2B、图2C。Transwell实验分析细胞迁移和侵袭实验结果见图3，过表达MT1M后A549迁移和侵袭能力明显降低(t分别为14.08、9.177，P均<0.001)，敲减MT1M(选择敲减细胞株shMT1M-2)后H1650迁移和侵袭能力明显增强(F分别为50.46、48.09，P均<0.001)。

2.3 NSCLC组织中MT1M的表达与患者预后间的关系 生存分析结果表明，对于TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期的NSCLC患者，MT1M阳性患者的总体生存期高于MT1M阴性患者(见图4A～图4C)，差异比较具有统计学意义(Log-Rank检验，χ2分别为21.19、10.13、6.10，P均<0.05)。此外，多因素Cox回归分析显示，NSCLC组织中MT1M的表达是NSCLC患者预后不良的独立危险因素(P<0.001，见表2)。

A.采用免疫印迹法检测正常上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞系中MT1M的表达；B.在A549细胞中使用慢病毒(lentivirus)稳定过表达MT1M，获得过表达细胞株PCDH-Lenti-MT1M flag(Lenti-MT1M)；C.在H1650中使用shRNA敲减MT1M，获得敲减细胞株pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-1(shMT1M-1)和pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-2(shMT1M-2)，选择GAPDH作为内参，**P<0.01，***P<0.001图2 免疫印迹法检测NSCLC细胞系中MT1M表达

A.过表达MT1M后A549细胞迁移和侵袭能力显著降低；B.敲减MT1M后H1650细胞迁移和侵袭能力显著增强图3 Transwell实验分析NSCLC细胞株A549和H1650的迁移和侵袭

MT1M阳性与MT1M阴性NSCLC患者比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS：无差异A.TNM Ⅰ期(48例)；B.TNM Ⅱ期(48例)；C.TNM Ⅲ期(45例)；D.TNM Ⅳ期(3例)图4 NSCLC患者MT1M表达与预后关系的Kaplan-Meier生存曲线

表2 NSCLC患者预后因素的单因素和多因素方差分析

3 讨论

以往有研究报道，MT1M在肝癌组织中低表达，并且可以诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移[7-8,13]，MT1M表达较低的肝癌患者术后复发率明显升高，预后往往不容乐观[9]，同时MT1M启动子甲基化状态可以作为肝癌血清诊断的标志物[11]，表明MT1M对肝癌的发生发展起到重要作用。本研究结果显示，MT1M在NSCLC组织中的表达明显低于癌旁组织，表明其低表达可能导致NSCLC组织上皮过度增殖或突变，进而形成肿瘤。

通常肿瘤细胞发生转移，首先要在原发灶侵袭基底膜，然后进入血管或淋巴结，进而发生远处转移，是否发生转移对患者的预后影响十分重要[14-15]。MT1M与患者临床病理参数相关性分析发现MT1M与NSCLC淋巴结转移呈负相关，患者越趋于淋巴结转移，组织中MT1M表达越低。体外细胞功能实验显示MT1M在NSCLC中可能具有抑制癌细胞迁移的功能。此外，生存分析结果显示，对于TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期的NSCLC患者，MT1M阴性的NSCLC患者总体生存期较MT1M阳性患者明显缩短，多因素方差分析显示NSCLC组织中MT1M的低表达是患者总体生存率的独立危险因素，提示MT1M在NSCLC中可以作为预后标志物，其低表达提示NSCLC患者预后不良。

本研究初步探讨了MT1M可能具有抑制NSCLC细胞侵袭转移的功能，其表达也可作为NSCLC患者潜在的预后标志物，但具体作用机制还需要进一步研究。