表观遗传治疗在结直肠癌中的应用

王玉柱， 郭明洲

1.中国人民解放军总医院第一医学中心消化内科，北京 100853； 2.中国人民解放军总医院第六医学中心干部病房消化内科

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是影响人类健康的恶性肿瘤之一[1]。外科手术、化疗和放疗是目前CRC治疗的基础手段，大多数早期CRC依靠手术治疗，通常可以获得较为满意的疗效，其5年生存率可超过90%，中-晚期CRC往往需要加入辅助放化疗，随着诊疗技术的进步，CRC的平均生存时间已经得到了有效延长。然而，Ⅳ期CRC的5年生存率却仅略高于10%[2]，寻找新的、有效的治疗策略是临床研究的重要方向。基于基因突变的小分子靶向药物和免疫治疗虽然取得了一些进展，但有效率仍然较低。近年来，表观遗传在血液系统肿瘤的治疗方面取得了显著的效果，在实体瘤中的临床研究正在广泛开展，可能是一个具有很好应用前景的治疗策略[3]。

1 表观遗传改变与CRC的关系

CRC的发生和发展涉及到很多遗传和表观遗传改变，由表观遗传改变导致的基因表达异常远高于基因突变所致的基因表达异常。经典的“表观遗传”改变是指，在DNA核苷酸的一级序列不发生改变的情况下，基因的表达出现可遗传的改变[4]。根据KNUDSON“二次打击学说”的原理，表观遗传异常在CRC发生过程中发挥着更重要的作用。目前已知有多种表观遗传修饰模式影响基因的表达，常见的包括：DNA的甲基化、组蛋白的共价修饰、通过非编码RNA进行转录后控制等[5]。研究表明，所有这些表观遗传修饰均参与CRC的发生、发展机制，其中DNA甲基化和组蛋白修饰是最早研究且较为深入的两种模式，目前已发现了许多表观遗传治疗的靶点[6]。

DNA甲基化在哺乳动物基因组中广泛存在，在基因组稳定、胚胎发育、细胞分化等方面发挥重要生理功能，而异常的甲基化改变被认为与疾病相关，其在恶性肿瘤中的研究最多。在全基因组水平DNA甲基化降低的同时，一些特定基因启动子区甲基化水平异常升高是肿瘤表观基因组的特征性改变[7]。基因启动子区高甲基化通常引起该基因的表达沉默，而关键抑癌基因的沉默是肿瘤发生、发展的重要原因；而一些发生在基因体部编码序列的高甲基化，又可能与一些促癌基因的过度表达有关[8]；另外一些涉及DNA损伤修复、细胞周期、信号通路关键检查点的基因，因甲基化导致表达沉默，也是肿瘤发病的重要机制，同时也是肿瘤对放化疗产生耐受的重要原因。

组蛋白修饰是另一类重要的表观遗传标志，组蛋白有多种修饰模式，表现为组蛋白末端发生的乙酰化、甲基化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、类泛素化等。组蛋白修饰通过影响染色质结构、募集重塑酶或转录复合蛋白来调控基因的转录、修复、复制和重组。目前在CRC中有关组蛋白修饰的研究，多数都集中在组蛋白乙酰化和甲基化[9]。组蛋白乙酰化通过对组蛋白电荷的影响，增加组蛋白与DNA间的排斥力，从而改变了染色质的二级结构，使转录因子可以接近基因启动子并与特异性的DNA结合位点相结合，从而激活基因转录[10-11]。组蛋白甲基化对基因转录的影响更为复杂，甲基化可发生在组蛋白不同位点的赖氨酸、精氨酸和组氨酸，且有单甲基化、双甲基化和三甲基化等不同程度的甲基化模式，不同的甲基化模式又可对转录产生不同的影响，表现出抑制或促进基因表达的作用[12]，这些效应作用于各种癌症相关基因，也成为癌症发生、发展的重要原因。

此外，近年有研究表明，非编码RNA和长链非编码RNA通过直接或与组蛋白相互作用调控基因的表达，从而影响信号通路和细胞周期等重要生物功能，促进或抑制肿瘤的发生和发展[13-14]。由于目前各种治疗方案均处于研究阶段，尚无成熟的方案作为共识，所以本文重点讨论表观遗传治疗策略。

2 表观遗传治疗药物对CRC的作用

针对上述介绍的表观遗传改变，已研发了多种抑制DNA甲基化和调控组蛋白修饰的药物，目前为止，已经有数种表观遗传药物被批准进行临床试验，此外还有100余种新的表观遗传药物正在进行临床前期试验。这些药物已获得的临床适应证几乎均为血液系统疾病，近期的很多研究开始关注其在CRC治疗中的应用。

2.1 DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi)阿扎胞苷(5-Azacytidine，5-AC)和地西他滨(5-Aza-2′-deoxycytidine，decitabine，DAC)是已经上市的两种DNMTi药物。阿扎胞苷能显著延长骨髓增生异常综合征(MDS)患者的生存时间，并降低MDS转变为急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的风险[15]。尽管对于阿扎胞苷的作用机制尚不完全清楚，但目前得到公认的一个重要机制是：它是一种胞嘧啶甲基化的有效抑制物，可与DNA结合，抑制DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的活性，降低DNA甲基化程度，使因高度甲基化而失活的抑癌基因恢复或上调表达[16]。地西他滨与阿扎胞苷作用机制类似，它同样在血液系统肿瘤的治疗中显示出良好的疗效。然而由于起初它们被用作细胞毒类抗肿瘤药物，在早期临床试验中显示出较高的毒性作用，所以早期对于DNMTi在实体瘤的治疗上的应用存在一些争议[17]。此后的研究发现，低剂量的阿扎胞苷和地西他滨，可改变多肿瘤细胞，包括结肠癌细胞中细胞周期、细胞分化、免疫调控和细胞死亡等多种肿瘤相关的重要生物效应，从而抑制肿瘤的发展[18]。此外还有多个研究表明，低剂量阿扎胞苷和地西他滨在联合伊立替康(Irinotecan)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、奥沙利铂(Oxaliplatin)等药物处理结肠癌细胞时，表现出协同抗癌效应，同时提高了结肠癌细胞对化疗的敏感性[19-20]。表明采用低剂量DNMTi联合其他抗肿瘤药，可能是一个具有很好应用前景的实体瘤治疗的新策略。

2.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)HDACi是另外一类已应用于临床的表观遗传药物，目前已经上市的包括伏立诺他(Vorinostat)、泛诺他宁(Panobinostat)、西达苯胺(Chidamide)、罗米地辛(Romidepsin)、贝利司他 (Belinostat)等，这些药物获准的临床适应证同样都是血液系统肿瘤。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的过表达或活性异常升高，是多种恶性肿瘤的特征性表现，HDACi可使HDAC受到抑制，产生诱导癌细胞周期阻滞、诱导癌细胞分化和凋亡的效应，还可以减少肿瘤血管生成、调节免疫应答，从而达到抑制肿瘤的作用[21]。有研究发现，抗真菌药物曲古抑菌素A(TrichostatinA，TSA)是一种HDACi，经TSA处理的结肠癌细胞株SW480和SW620中的KRAS、NF-κB、Akt/mTOR等致癌标志物明显降低，且TSA和5-FU具有协同抗肿瘤作用，同时TSA可能还抑制结肠癌干细胞对5-Fu的抗药性[22]。贝利司他(Belinostat)和5-Fu共同处理体外培养的结肠癌细胞HCT116，对该细胞增殖和克隆形成能力具有协同抑制作用[23]。还有研究发现，低浓度的罗米地辛(Romidepsin)在HCT116、HT29和SW48等结肠癌细胞模型中增强了5-Fu的抗肿瘤活性，进一步研究表明，这种抗癌作用的机制是通过caspase-3/7激活、诱导细胞凋亡、上调p21水平诱导细胞周期停滞和诱导MHC Ⅱ类基因表达而发挥作用的，这也提示表观遗传治疗可能与免疫治疗具有协同效应[24]。这些研究结果表明，HDACi药物不仅具有逆转CRC细胞对化疗药物耐受的能力，且还与这些药物协同作用相关。

3 表观遗传药物治疗CRC的临床试验

大量实验室研究表明，DNMTi和HDACi药物在血液系统肿瘤中的成功应用为表观遗传治疗在实体瘤中的应用奠定了理论基础，研究者们已经逐步将这类药物运用到临床实体瘤的治疗，在CRC的治疗中，数种表观遗传治疗药物已进行了不同临床试验阶段，更多新的临床试验将会不断出现。

最初应用单一DNMTi药物治疗晚期结肠癌的临床试验显示，疗效不佳且不良反应较大，认为DNMTi并不适合作为独立抗肿瘤药物治疗CRC[25-26]。此后的研究通过调整为低剂量的DNMTi药物与化疗药物、分子靶向药物等药物联合应用，获得了不同效果。在一项应用地西他滨联合帕尼单抗(Panitumumab，一种EGFR单克隆抗体)治疗转移性结肠癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，患者表现出对该方案有较好的耐受性，但该方案并未获得明显的效果[27]。同样在一项阿扎胞苷联合CAPOX(卡培他滨和奥沙利铂)化疗方案治疗结肠癌的研究中，结果也显示药物耐受性良好，但并无明显的临床疗效[28]。有一项研究发现，用低剂量地西他滨预处理已经对化疗或自体细胞免疫疗法(cytokine-induced killer，CIK)抵抗的难治性结肠癌患者，随后再次进行化疗和CIK治疗，部分患者疾病的客观缓解率和疾病控制率有所提高，这提示地西他滨可能促使对化疗和免疫治疗耐受的结肠癌恢复治疗敏感性[29]。

HDACi药物用于CRC的治疗结果与DNMTi药物类似，单一用药对CRC几乎无任何治疗效果，因此联合用药也成为HDACi药物用于实体瘤治疗的新策略[30-31]。于是在随后的几项试验中，尝试了伏立诺他与5-Fu、四氢叶酸和奥沙利铂联合治疗CRC，但并未观察到显著的疗效[32-34]。然而，在一项伏立诺他联合帕唑帕尼(Pazopanib)治疗实体瘤的临床试验观察到，虽然对于全体试验组的平均疗效并不满意，仅有5%的部分缓解(partial response，PR)和14%的疾病稳定(stable disease，SD)超过6个月的病例。在这些病例中具有TP53基因突变的转移性CRC患者具有更高的PR和SD比例、更长的无进展生存期(progression-free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS)[35]，表明表观遗传治疗可能针对特定表型更有效。

在这些初期的临床试验中，DNMTi和HDACi药物虽然未展现出令人满意的临床疗效，但仍提供了一些有参考价值的线索：例如对于实体瘤包括CRC治疗，单独应用DNMTi和HDACi制剂并不可取，而合理的用药策略是联合放疗、靶向治疗或免疫治疗，DNMTi和HDACi制剂在其中发挥协同效应或增敏剂的作用；又如一些特定亚型的CRC对表观遗传治疗的反应似乎优于整体疗效，这提示通过特异性的肿瘤标记物的检测，选择合适的患者群体可能使部分病例从治疗中受益。另一方面，表观遗传药物的进一步应用，仍有些重要的问题有待研究：首先，合理的给药剂量和给药方式，对于协调有效性和安全性方面至关重要，后期仍需要不断试验摸索；其次，表观遗传药物不仅对癌细胞或目的基因有效，对正常细胞或正常基因同样起作用，这种非选择性的表观调控，可能导致并非所有的肿瘤类型都能从治疗中获益，甚至出现不可预估的风险，或许将来可借助新的分子生物技术手段，实现精准定位的表观遗传干预。

4 新方向和展望

随着表观遗传治疗研究的不断进展，大量新的表观遗传治疗方法随之问世，目前还有多种针对组蛋白乙酰化和甲基化的新型的抑制剂正处于研发阶段，其中包括溴结构域蛋白(bromodomain and extraterminal domain，BET)抑制剂、赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)抑制剂、异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变抑制剂、组蛋白甲基转移酶(HMT)和蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)抑制剂等。BET抑制剂最近成为抗肿瘤研究的热点，BET抑制剂单独或与其他抗癌药物的联合使用，已在多种肿瘤中显效[36-37]，许多治疗方案已经进入临床试验阶段。另外，表观遗传治疗与新兴的抗肿瘤治疗药物联用的尝试，也出现新的契机，例如有实验发现，低剂量地西他滨可以通过增加免疫相关基因的表达，改变肿瘤微环境，提高低微卫星不稳定性或稳定微卫星的结肠癌对PD-1阻断剂的敏感性[38]。

表观遗传药物从最初的种类少、毒性大、疗效欠佳，发展到目前有多种药物已经或即将上市，药物耐受性逐步提高，联合多种治疗方式用于实体瘤治疗取得进展，由此我们有理由相信，表观遗传治疗有着广阔的前景。