诺如病毒的致病机制及诊断

周弘璐，谭明，汪萱怡,4

1. 复旦大学上海医学院基础医学院教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室，上海 200032； 2. 辛辛那提儿童医院医学中心传染病室，辛辛那提，俄亥俄州，美国; 3. 辛辛那提大学医学院儿科系，辛辛那提，俄亥俄州，美国; 4. 复旦大学附属儿科医院，上海 201102

感染性腹泻为国际上公认的5岁以下儿童第2位死因[1]。随着社会经济的发展和卫生条件及饮水设施的改善，细菌和寄生虫感染得以控制，感染性腹泻的病原逐渐以病毒为主。由于轮状病毒(rotavirus,RV)疫苗的推广，诺如病毒(norovirus, NoV)已取代RV成为病毒性急性胃肠炎的第一病原体，并因此越来越引起全球的关注[2]。NoV是引起全人群急性胃肠炎(acute gastroenteritis, AGE)流行和暴发的主要病原体，也是引起食源性疾病的最常见非细菌性病原体[3]。NoV主要以粪-口途径传播，平均潜伏期为12～48 h，典型症状包括呕吐(≥50%的病例)、腹泻、恶心、腹部绞痛、肌肉痛、低热等，持续2～3 d，具有良好的自限性。但在<5岁儿童、>60岁老年人以及免疫功能缺陷患者中可引起严重的疾病，导致脱水、休克甚至死亡[4]。

1 NoV的病毒学特性

NoV属于杯状病毒科NoV属，为单股正链的小RNA病毒，无包膜，直径为27～40 nm，呈二十面体对称球形。基因组全长约7.7 kb，包含3个开放读码框(open reading frame, ORF)ORF1、ORF2和ORF3[5]。ORF1编码1个多聚蛋白，翻译后裂解成为6种非结构蛋白(non-structure protein，NS)，在病毒复制中起重要作用。ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白(major structural protein，VP1)和次要结构蛋白(minor structural protein，VP2)。X线晶体结构分析显示，衣壳蛋白VP1包含两大结构域，分别是壳区(shell 或 S domain)和突起结构域(protruding 或 P domain)，后者可进一步分为提高病毒稳定性的P1亚结构域和高度可变的P2亚结构域，P区和S区通过柔性的铰链区连接，高变的P2区决定病毒的抗原性，但位于P2区的受体结合部位相对保守，与宿主受体结合，启动感染。成熟的病毒颗粒包含180个VP1蛋白，组成90个二聚体，形成二十面体对称结构。早期依赖电镜方法对病毒进行描述区分，NoV在电镜下显示杯状结构(cup-like structure)，故称杯状病毒。最近研究表明，NoV和宿主受体结合后，杯状病毒的次要衣壳蛋白VP2形成一穿透衣壳的特殊通道，帮助NoV释放基因组RNA到宿主细胞[6]。

NoV宿主广泛，可感染人类、啮齿动物、猫科动物、犬科动物、海狮、猪、绵羊、牛、蝙蝠等。NoV具有高度的基因多态性，根据VP1蛋白序列及其编码的序列不同，可将其分为7个基因组(GⅠ～Ⅶ)，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ能感染人类并致病，所以又称人源诺如病毒 (human norovirus, HuNoV)，至少包括30种以上的基因型，其中GⅡ.4是造成全球NoV暴发和流行的主要基因型[7]。但在2014―2015年冬季，日本和中国上海、北京、浙江、江苏、广东等东亚地区都相继出现新型GⅡ.17，成为AGE暴发的主导毒株[8]。此外，2016年10―12月，中国NoV病例暴发数与前4年同期相比大幅增加，79%由重组株GⅡ.P16-GⅡ.2引起[9]。

2 感染及致病机制

HuNoV尚未能常规培养，而且缺乏有效的动物疾病模型，因此对HuNoV的感染及致病机制仍未十分了解。目前HuNoV感染及致病数据主要来源于志愿者攻毒试验，志愿者攻毒试验对HuNoV感染后发病机制的研究具有重要意义，但实践中受许多因素的限制，如不能针对特定基因缺陷的个体，获取感染时的组织样本也颇受限制。因此，考虑到基因和环境因素的可操作性，动物感染模型多应用于NoV与宿主间相互作用的研究，如无菌猪、无菌牛、黑猩猩、免疫缺陷小鼠等。其中应用最广泛的为鼠诺如病毒(murine norovirus, MuNoV)感染系统。

2.1 NoV的细胞嗜性

近年来，体内、外研究显示NoV对免疫细胞和肠上皮细胞(enterocyte)具有感染性。在体外细胞培养试验中，MuNoV能感染巨噬细胞、树突细胞和B细胞[10-11]；而HuNoV能低程度感染B细胞[12]，却不能感染巨噬细胞和树突细胞[13]，可见HuNoV与MuNoV的细胞嗜性不尽相同。更加有趣的是，无论是HuNoV还是MuNoV，在B细胞中复制都不会造成明显的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)，而在巨噬细胞和树突细胞中复制则会引起细胞裂解。与此发现相一致的是，MuNoV能在B细胞却不能在巨噬细胞和树突细胞中持续感染[14]。这些现象令人颇为惊讶，因为有包膜的病毒可以通过出芽的方式从细胞内释放，而NoV作为无包膜的病毒理论上需裂解细胞才能释放出后代病毒颗粒。

作为感染肠道、引起腹泻的HuNoV，它们的靶细胞一直被认为是肠上皮细胞，这些假设已在早期的人体攻毒实验和活组织检查(biopsy)中[15]得到初步证实。与此类似，在HuNoV感染无菌牛和无菌猪的肠组织中，检测到NoV阳性的肠上皮细胞[16-17]。此外，Ettayebi等[18]在体外干细胞来源的人类类肠细胞中成功复制HuNoV，进一步证实肠上皮细胞是HuNoV的宿主细胞。最近，Wilen等[19]发现一种罕见的肠上皮细胞——丛细胞(tuft cell)，它能表达CD300If，是小鼠肠道MuNoV的靶细胞，且2型细胞因子通过诱导丛细胞增殖促进MuNoV感染。需要指出的是，尽管NoV能感染肠上皮细胞和免疫细胞，而且基于肠上皮细胞和免疫B细胞的HuNoV培养系统[12, 18]已被建立，但其培养条件苛刻、复杂且随基因型变化，导致HuNoV复制效率低下，难以用于中和抗体检测。所以NoV的体外培养仍是细胞嗜性研究中的一大挑战。

病毒感染需要跨越肠上皮屏障，转移至下层免疫细胞，进而有效诱导免疫和炎症反应。在这个过程中，一种特化的肠上皮细胞——M细胞发挥了重要作用。M细胞位于肠腔的派尔集合(Peyer’s patches)淋巴结并散布在淋巴滤泡中，虽然其顶端表面缺乏微绒毛，也不分泌黏液，但能选择性摄取和转运抗原至下层免疫细胞[20]。很多病原体能利用M细胞跨越肠上皮屏障，如依赖CXCR4受体蛋白的嗜淋巴细胞(X4)可与M细胞上的CXCR4受体结合，穿过上皮细胞[21]。研究显示，NoV也可利用M细胞穿过肠上皮屏障。首先，即使在没有病毒复制和破坏肠上皮细胞完整性的情况下，M细胞也能介导HuNoV和MuNoV通过极化的单层肠上皮细胞，在顶部内化，然后在基底部释放，释放的病毒仍能有效地感染基室内潜在的免疫细胞[22]。M细胞表达的特异性表面蛋白受体如b1整合素和糖蛋白2可能有助于病毒颗粒的黏附而协助感染活动[23]。此外，Gonzalez-Hernandez等[22]发现在M细胞缺失的小鼠中，两种不同的MuNoV毒株复制均减少，但仅为减少而不是完全消失，这表明存在额外的病毒摄取途径，可穿过肠上皮屏障。无论如何，这些结果直接或间接地支持了NoV利用M细胞跨越屏障并感染免疫细胞的假说。

2.2 NoV受体或附着因子及个体易感染性

肠上皮表面的组织血型抗原(histo-blood group antigens，HBGA)被认为是NoV的宿主受体或附着因子[24]，与HBGA的相互作用使得NoV得以附着宿主细胞，启动病毒感染。HBGA是一类含岩藻糖的复合糖类，除了分布在红细胞表面，还广泛分布在呼吸道、泌尿生殖道和消化道黏膜细胞表面，也可以游离寡聚糖的形式存在于生物体液中，如唾液、肠液、乳汁和血液[25]。HBGA包括常见的H/A/B抗原(对应O/A/B血型)，以及Lea、Leb、Lex、Ley抗原(对应Lewis血型)。H/A/B抗原分别在HBGA前体的基础上由对应的糖基转移酶(分别叫FUT2、A酶和B酶)催化形成，Lewis血型则由FUT3酶催化产生。不同HBGA表型的个体与NoV结合能力不同。有研究显示，有些NoV，比如诺瓦克病毒GI.1，与H/A抗原的结合能力高于B抗原[26]；使得O表型的个体相对于B表型的个体更容易被诺瓦克病毒感染[27]。

FUT2基因编码α(1,2)-岩藻糖基转移酶，该糖基转移酶可在HBGA前体上加上一个α(1,2)-岩藻糖，使之成为ABO抗原的前体H抗原。具备FUT2基因和FUT2酶活性的个体，被称为“分泌型”(secretor)；约有20%的个体因FUT2基因突变导致FUT2酶失活，从而不能表达ABO抗原，被称为“非分泌型”(non-secretor)。在欧美国家，FUT2基因的428 (G→A)纯合无义突变最常见，该突变导致无法合成H抗原，所以这些个体被称为非分泌型；而在亚洲国家，FUT2基因的385 (A→T)错义突变更普遍，突变后仍可表达低水平的H抗原，这些个体常被称为“弱分泌型”[28]。

分泌型个体对大多数NoV，尤其是常见的 GⅡ.4 NoV易感，而非分泌型个体对大部分NoV耐受，所以NoV感染有基因型特异性，其中基因型GⅠ.1和GⅡ.4表现尤为显著[29]。然而在分泌型个体中，也有部分抵抗NoV感染，说明HBGA基因遗传的差异并不能完全解释NoV的易感性，免疫记忆或其他一些未知的因素也可能对NoV感染提供保护作用。此外，研究显示非分泌型个体也对特定基因型的NoV敏感[30-31]。比如，Shirato等发现GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.8、GⅡ.4和GⅡ.7能够与Lea抗原(非分泌型个体特有的血型抗原)结合；在瑞典GⅠ.3 NoV暴发调查中发现，不同表型的个体之间发病情况没有明显差异，且GⅠ.3也能和Lea抗原结合[30]；分别由GⅡ.3和GⅡ.4引起的胃肠炎暴发事件中，都出现了非分泌型个体发病的情况。这些研究结果的差异也可能由于地区、种族、毒株变异等不同引起。因此，NoV的易感和耐受机制需要进一步探索和验证，尤其是那些文献中不曾记载的基因型。早期研究表明，HBGA结合位点在P区结构域内[32]，进一步通过P区结构域和HBGA寡聚糖共结晶及X-射线分析[33]显示，HBGA结合位点位于NoV突出区结构域的顶端(P2区)，即病毒的最外端。该位点属于构象型结构(conformational structure)，由数个不连续的氨基酸构成。HBGA结合位点在GⅠ和GⅡ基因组(genogroup)内各自保守。总体而言，它们大致可分为两大区域，分别是中心部位的保守区和周围的高变区[25, 34-35]。中心保守区为NoV感染宿主关键处，即为病毒存活所必须，而高变区对NoV进化及扩展易感人群具有重要意义。

2.3 肠道共生菌对NoV感染的影响

肠道共生菌在调节病毒感染方面也发挥了重要作用。Jones等[11]通过HuNoV感染B细胞系的体外试验发现，肠道共生菌表面表达的人类HBGA受体能够促进NoV感染B细胞。此外，肠道菌群可能通过抑制诱导IFN-λ信号，直接或间接促进病毒复制[36]。而利用抗生素消耗小鼠肠道内微生物群后发现，MuNoV的复制水平降低，从侧面印证了肠道共生菌能够促进NoV感染[37]。相反，Lei等[38]通过HuNoV感染无菌猪的体内试验发现，肠道共生菌(E.cloacae)会抑制HuNoV感染，病毒颗粒脱落减少，肠道组织中的病毒滴度降低，且没有在B细胞中观察到HuNoV感染。与此类似，Lee等[39]利用RAW264.7细胞系体外验证了乳杆菌(Lactobacillus)抗MuNoV感染的作用。由此看来，肠道共生菌对于HuNoV或MuNoV感染的作用并没有很好的一致性，可能受到体内和体外试验条件、实验动物模型、感染细胞系种类等多种因素的潜在影响，这些问题有待将来的研究澄清。

2.4 NoV感染导致的病理学变化

在HuNoV攻毒试验中，给予志愿者诺瓦克病毒(Norwalk; GⅠ.1)或夏威夷病毒 (Hawaii; GⅡ.1)后取其近端小肠活检标本。镜检显示，肠绒毛钝化变宽，微绒毛缩短，线粒体变大，隐窝细胞增生，胞质空泡形成，多核和单核细胞渗入固有层，表现出轻微的炎症浸润。虽然NoV感染志愿者显现肠上皮细胞异常，但细胞和黏膜却保持完整状态[15, 40-41]， 胃底和胃窦内未见组织学改变[42]。小肠刷状缘酶活性(碱性磷酸酶、蔗糖酶和海藻糖酶)下降，造成轻度脂肪痢和短暂碳水化合物吸收不良[43]。空肠腺苷酸环化酶活性并没有升高，胃酸、胃蛋白酶的分泌以及其他内在因素可能与这些组织学改变有关。而胃排空延迟、胃动力减弱可能与胃肠炎的恶心、呕吐症状有关[44]。总体而言，由于缺乏有效的NoV感染致病动物模型，由HuNoV感染引起的AGE的致病机制目前还不是很清楚，有待进一步研究来解释。

3 NoV感染的诊断学

虽然在直肠拭子和呕吐物中都可以检测到NoV，但粪便中病毒含量相对较高，故将其作为临床首选标本。在1990年NoV基因组成功克隆和测序之前[45]，电子显微镜(electron microscopy, EM)是检测病毒的唯一方式。根据第1批病毒的收集地点和EM观察到的形态学结构，将其命名为诺瓦克样(美国俄亥俄州诺瓦克镇)病毒或小圆结构病毒(small round structural virus)，现正式命名为诺如病毒。由于EM观察的NoV分辨率低，不易与其他胃肠炎病毒区分，而且该方法耗时、昂贵，不适宜在日常诊断中使用。此外，由于NoV基因型和抗原性的多样性以及抗原漂移的存在，对酶免疫试验(enzyme immunoassay, EIA)试剂盒的研发及应用构成困难和挑战。

3.1 分子生物学诊断

20世纪90年代，开发了第1个针对NoV ORF1区聚合酶基因(region A)的传统反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[46]。随着可利用序列的增加，RT-PCR方法被不断优化，特别是改善引物设计使其具有广谱反应性，现能检测绝大部分的NoV流行株[47]。NoV广谱RT-PCR的关键就是找到可用作PCR引物的保守序列，扩增特定区域后可用于测序、分型。这些区域包括编码聚合酶的基因(region A和B)以及编码衣壳蛋白的基因(region C、D和E)，其中最常用的是region A和region C，比较多聚酶和衣壳序列可判断毒株是否重组[47]。《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南》(2015版)方案推荐利用衣壳蛋白的部分区域(region C)来对NoV进行分型，引物G1SKF、G1SKR和CoG2F、G2SKR分别用于GⅠ和GⅡ的检测[48]。

与传统的RT-PCR相比，实时定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-quantitative PCR assays, RT-qPCR)具有更高的灵敏度和特异度，使用荧光标记的寡核苷酸探针，不需要琼脂糖凝胶电泳分析。一步法RT-qPCR试验中，反转录和cDNA扩增在一个反应中进行，样品处理更加简单，降低了交叉污染的风险，更适合于临床实验室检测。虽然目前很多PCR针对病毒的聚合酶基因，但序列分析显示ORF1-ORF2连接处的保守区域也可作为引物和探针设计[49]。尽管美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)还没有批准商业化NoV RT-qPCR检测试剂盒，但该方法显然已经成为NoV检测的金标准，用于检测粪便、呕吐物、血清、食物、水等多种形式的标本。而且，RT-qPCR设有内部质控，可以减少假阴性结果，并能同步检测GⅠ、GⅡ和GⅣ株[50-51]。同时，RT-qPCR可以半定量方式测定样本中的病毒载量。研究显示，病毒载量高的患者病毒脱落时间更长，通常GⅡ基因组的粪便病毒载量高于GⅠ组[52]。但是，RT-qPCR分析灵敏度高，可以检测到含量极低的病毒，无症状的感染者或几周前感染现已恢复的个体中仍可能检测到NoV，因此，若症状发作后超过3～5 d收集样品并具有高循环阈值(即低病毒载量)，应谨慎分析，以确定AGE的病因。

3.2 多病原体检测平台

近年来，多种胃肠道病原体检测平台相继问世，能同时检测十余种致病性肠道病毒、细菌和寄生虫，较传统方法更加灵敏、快捷，可用于临床快速诊断。FDA批准的xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel (GPP) (Luminex, Austin, TX)平台可以同步检测包括NoV在内的3种病毒、3种寄生虫及7种细菌，并能区分NoV GⅠ/GⅡ基因组，其灵敏度>90%，特异度近100%[53]。与此类似，FilmArray GI panel能够同时检测包括NoV在内的23种病原，但不能区分NoV GⅠ和GⅡ基因组，除了个别的病原体，其总体灵敏度同样>90%，特异度达100%。与xTAG GPP相比，FilmArray GI样品处理更简单，出结果的时间更短，缺点是一次只能分析1个样本，8 h只能处理7～8个样本。相比之下，xTAG GPP通量更高，8 h能够处理多达64个样本，所以更适合大批量检测。但是xTAG GPP是一个开放平台，增加了复制子污染风险，故应使用单向工作流并注意实验室操作规范[54]。此外，Life Technologies开发的TaqMan Array Card (TAC)是点阵芯片卡RT-qPCR平台，通过空间分布来实现多病原的检测。它是由384个孔组成的微流体芯片卡，被分成8个区域，每个区域包括48个孔，预装有特异性引物和TaqMan探针，每卡可加载8个样本，同时检测19种病原。与使用相同引物和探针的RT-PCR Luminex assay相比，TAC的灵敏度为100%，特异度为96.2%[55]。虽然这些检测平台可以快速诊断多种病原，但因经常出现混合感染和缺乏定量数据，故可能无法确定胃肠道疾病是由哪种病原造成，需要通过别的方法进一步验证。

3.3 二代测序

二代测序(next-generation sequencing, NGS)技术因具有高通量、高灵敏度等优势而被广泛用于基因组学的研究。NGS可不依赖于特异性引物而得到NoV的全基因组序列，及时发现异于常见毒株的新突变株，丰富参考序列数据库，追踪NoV的起源和基因进化，从而预测其潜在的暴发和流行。NGS一个极大的优势是，所有病毒(高于敏感阈值)都可在产生的序列中表示，为临床样本提供重要的共感染数据[56]。然而，NGS从文库制备到测序分析需要至少24～48 h，且需要专门的人员和设备；另外，价格昂贵，每个样本需要100～200美元。NGS对于低丰度病毒的测序非常有用，但这也提高了样本之间发生交叉污染的风险。

4 展望

目前，对HuNoV感染致病机制的了解大部分来自人体攻毒试验研究，以及主要利用小鼠模型进行的替代研究。这些模型受成本、试剂和伦理的限制。尽管小鼠模型成本低廉，但无法繁殖HuNoV。MuNoV和HuNoV在与宿主的相互作用及引起疾病方面有很大差异。因此，未来的致病机制研究应聚焦更能代表人小肠上皮细胞的体内与体外模型的构建，包括能感染HuNoV的动物感染与疾病模型，以及人小肠类器官模型。此外，还应关注肠道微生态与HuNoV感染、复制和致病的相关性，以全面理解NoV的致病机制，为疫苗和治疗药物的研发，乃至最终治疗和预防NoV胃肠炎提供不可或缺的基础。