载麦冬皂苷的明胶微球对成骨细胞的调控作用

2019-12-20

福建工程学院学报 2019年6期

(福建工程学院材料科学与工程学院, 福建福州 350118)

目前甾体皂苷类化合物的应用及研究领域主要集中在中枢神经损伤的治疗方面，甾体皂苷类化合物应用于骨缺损治疗领域的研究报告还很少见。江洋珍等[1]研究了薯蓣皂苷元(麦冬甾体皂苷的主要水解产物，分子式：C27H42O3，相对分子质量：414.63Da)对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。研究发现，在培养液中添加质量浓度(0.015～0.150 μg/mL)的薯蓣皂苷元后，成骨细胞增殖、分泌碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的水平明显提高。

与此同时，构建具有时空控制释放特点的载药微球已成为一个新的研究方向[2-3]。连续梯度的化学信号能引起浓度依赖性的细胞特异类型反应，从而引起不同的生物学作用[4]。这种微球对于骨缺损的修复具有较好的药物缓释作用。微球可直接植入骨缺损部位以刺激骨细胞的增殖。此外，这种尺寸可控的载药微球也可以注射的方式修复损伤组织，从而避免手术创伤。因此，这种治疗方式可有效提高骨细胞的生物活性并刺激骨再生。

基于此，本实验尝试以麦冬甾体皂苷为模型药物，以明胶为载体构建缓释系统并研究其对小鼠成骨细胞的生物效应。

1 材料与方法

本实验以从麦冬提取物中分离得到的甾体皂苷类化合物(相对分子质量介于771-962Da)作为模型药物，应用新型乳化-化学交联技术，制备载药明胶微球。微球在制备过程中, 麦冬-明胶溶液与油相形成W/O型乳剂, 再经EDC/NHS固化交联处理形成微球。

具体过程如下：

(1)配制药物-明胶溶液。将0.3 g麦冬皂苷溶于100 mL水中, 超声处理,配制成饱和溶液后, 称取明胶溶液，配制成适宜浓度的麦冬皂苷-明胶溶液。

(2)乳化。在三口瓶中加入250 mL液体石蜡，然后加入3.1 mLSpan80，搅拌使液体石蜡与Span80 混匀。并在搅拌下缓慢滴加含药明胶溶液，控制一定的搅拌速度，适时取样，用显微镜进行观察。水相与油相体积比控制为1∶5，石蜡与Span80的体积比控制为80∶1。并调控乳化时间为40 min。

(3)交联阶段和后处理。当液滴完全分散均匀形成W/O型乳剂后，立即转移至冰水浴中；待乳剂温度降至5 ℃左右时，加入2.5 mg/mL的EDC交联固化40 min，随后加入异丙醇约50 mL，继续搅拌至有大量固体颗粒析出(约15 min)，抽滤，用异丙醇洗涤3次，用石油醚洗涤3次，直至抽干，放在表面皿上，拿到真空干燥箱里真空干燥12 h，即可得粉末状麦冬-明胶微球。

2 载药明胶微球的性能检测

2.1 载药明胶微球的微观结构观察及粒径分析

利用扫描电子显微镜(SEM)观察载药明胶微球的表面形态和微观结构，并在光学显微镜下测量100个微球粒径，绘制粒径分布图。

2.2 载药明胶微球的药物释放动力学和质量变化分析

采用紫外分光光度计检测载药微球在PBS中的释放动力学，绘制体外药物释放曲线；并称量释药前后微球的质量变化，绘制降解曲线。

2.3 载药明胶微球对细胞的生物效应检测

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养成骨细胞。成骨细胞足够多时，加入0.25%的胰酶消化成骨细胞，1～2 min后弃除胰酶，加入培养液中止消化，冲下贴壁的成骨细胞，吹打均匀制成细胞悬液，于红细胞记数板上记数。根据细胞记数结果，将细胞悬液密度稀释成1×104个/mL和 2×104个/mL两种，备用。之后，将20 mg经γ射线消毒后的微球置于培养板中，用培养液浸泡24～48 h。之后，除去培养板中培养液，加入配制好的细胞悬液，隔天换新的培养液。细胞与微球组装一定时间后，采用四唑盐(MTT法)比色法检测细胞生长的情况，采用铁氰化钾法检测细胞的碱性磷酸酶活性，并采用相差显微镜观察细胞的矿化特征，评价明胶微球释放的甾体皂苷药物对成骨细胞的生理活性。

3 载药明胶微球的性能特征

3.1 载药明胶微球的微观形貌及粒径分析

图1为包裹了麦冬甾体皂苷药物和未载药明胶微球的扫描电镜形貌图。从图1可以看出未载药的微球表面更光滑，而包裹了药物的微球表面较粗糙。微球粒径在1 μm到9 μm之间，粒径分布如图2所示，平均粒径为(7.5±0.8)μm。

图1 明胶微球的扫描电镜形貌图Fig.1 Scanning electron micrographs of the gelatin microspheres

图2 明胶微球的粒径分布图Fig.2 Particle size distribution of gelatin microspheres

采用的双乳化技术可以通过控制表面活性剂浓度和混合转速来控制明胶微球的粒径。但是，这种技术也存在局限性。在乳化过程中，有机介质对明胶的流体力学作用会破坏明胶的螺旋结构，并降低其力学强度，从而导致药物从明胶基质中快速扩散出来。为了改善这种缺陷，本实验对明胶微球进行了交联处理。此外，通过交联，也可以对明胶构建最佳密度的纤维网络，这对于药物的缓释进而促进骨传导具有极其重要的作用。

3.2 载药明胶微球的药物缓释特征

图3为载药微球溶液经高速离心后，紫外分光光度计进行吸光度测定所得曲线。药物在波长274 nm处的吸收峰为麦冬甾体皂苷的特征吸收峰，表明微球载药成功。

图3 药物明胶微球的吸光度曲线Fig.3 Absorbance curve of the gelatin microspheres

本实验研究了载药明胶微球在PBS溶液中的药物缓释特征。图4为明胶微球的药物释放特征和降解速率曲线。从图4(a)可以看出，在起初的6 d，药物具有较快的释放速率。随后，释放速率减慢并保持在相对平稳状态。药物在0～3、4～6、7～9、10～12 d的释放量分别是5.15、1.93、1.07、0.73 μg/mL。

图4 明胶微球在PBS溶液中的药物释放曲线和降解曲线Fig.4 Drug release curve and degradation curve of gelatin microspheres in PBS solution

另外，从图4也可以看出，明胶微球在PBS中的降解曲线与药物释放曲线的变化趋势非常类似。表明在微球降解过程中，药物释放速率与明胶降解速率相一致。而且微球的药物突释现象并不太明显，具有较好的释放特征。事实上，甾体皂苷从微球中释放既包含扩散机制，也有生物侵蚀的原因。明胶微球的释放曲线主要取决于明胶的降解，而甾体皂苷的持续释放可以被解释为明胶的降解。明胶在PBS中可以快速降解，但是本实验的交联处理减缓了明胶的降解速率，并延长了药物的释放时间。

3.3 载药明胶微球对成骨细胞生理功能的调控作用

3.3.1 载药明胶微球对成骨细胞增殖率的调控作用

图5显示了成骨细胞MC3T3-E1分别与纯明胶微球、载药明胶微球复合培养时的增殖率。从图5可以看出，当与载药明胶微球复合培养时，细胞增殖数量更多(P<0.05)。这表明药物在成骨过程中具有重要作用，可很好地促进成骨细胞繁殖。

3.3.2 载药明胶微球对成骨细胞分泌ALP的调控作用

细胞与两种微球复合培养7 d后分泌的ALP水平如图6所示。在本实验中，细胞分别以两种初始浓度(1×104个/mL和2×104个/mL)种殖在20 mg的微球上。从图6可以看出，在两种浓度情况下，细胞与载药微球复合培养时分泌的ALP水平更高。而且，细胞初始浓度越高，ALP增加的越多。这表明药物能很好的激发细胞分泌成骨因子。

图6 细胞分别与纯明胶微球、载药明胶微球复合培养7 d后分泌的ALP水平Fig.6 Level of ALP of secreted by cells after 7 days of co-culturing with pure gelatin microspheres and drugs-loaded gelatin microsphe resrespectively

明胶微球释放的甾体皂苷药物及微球材料均对细胞的粘附、增殖及分泌具有重要作用。因此，这种复合微球可构建具有生理活性肽片段的亲水表面，并以此作为细胞表面受体的配体。

3.3.3 载药明胶微球对成骨细胞矿化的调控作用

采用相差显微镜观察细胞的矿化，进一步评价明胶微球释放的甾体皂苷药物的生理活性。从图7(a)可以看出，细胞与载药明胶微球复合培养10 d后有尖棱状矿化晶体形成。

图7 细胞分别与载药明胶微球和纯明胶微球复合培养10 d后的矿化形貌图(×200)Fig.7 Mineralization topography (×200) of cells co-cultured with drug-loaded gelatin microspheres and pure gelatin microspheres for 10 days respectively

作为对照同时研究了未载药的明胶微球对细胞矿化的影响。从图7(b)可以看出，这些微球与细胞联合培养后，细胞未矿化形成晶体。由此也可以证实甾体皂苷药物对细胞矿化的生理活性。

究其原因，可推测为甾体皂苷药物对成骨细胞内的护骨素(osteoprotegerin, OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)mRNA表达具有影响。可通过显著上调成骨细胞内OPG/RANKL比值来调节成骨细胞的生理活性。因此，这种具有骨诱导功能的载药微球可被注射或移植到骨缺损处以刺激成骨细胞向骨组织分化，有效促进新骨形成。