利用SSR标记对不同耐盐紫花苜蓿遗传多样性分析

麻冬梅， 张喜斌， 黄 婷， 王文静， 赵丽娟， 马巧利

(宁夏大学西北土地退化与生态系统恢复省部共建国家重点实验室培育基地/西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室/宁夏大学生命科学学院/宁夏大学农学院， 宁夏 银川 750021)

近几十年随着工业化步伐的不断加速以及人们不合理的开发利用，导致了生态环境的不断恶化，其中土壤盐渍化程度不断加深扩大已经成为人类面临的世界性问题，土壤盐渍化严重的制约着生态环境和农业及畜牧业的发展[1]。因此选育优良的苜蓿耐盐新品种对改善草地环境提高草地肥力具有重要的生态意义。分子标记辅助选择(Marker assisted selection,MAS)快速、准确且不受环境因素的干扰，大大提升了育种的效率、缩短了育种周期。目前已经成为了小麦(TriticumaestivumL.)、水稻(OryzasativaL.)、大豆(Glycinemax(L.) Merr.)、高梁(Sorghumbicolor(L.) Moench)等作物育种的重要手段。

简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)包含的多态性信息含量高，共显性标记、易操作、耗费低、实验结果可靠等优点，已广泛用于各种作物的遗传多样性研究中[2-3]。它是研究遗传多样性最有效的方法之一[4]。目前，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)微卫星的研究相对滞后，已经开发出的分子标记和能够利用的标记较少。吴宗怀[5]利用SSR标记技术，研究了6份苜蓿的遗传多样性，结果表明 6份材料在群体内具有较高的变异。Diwan等[6]在四倍体苜蓿基因组中筛选出4个SSR位点符合孟德尔分离规律。张栋[7]利用3对SSR引物构建苜蓿指纹图谱，应用于品种鉴定。武自念等[8]利用SSR分子标记对80份多叶苜蓿自交一代自交系单株进行分子检测，结果表明SSR标记聚类结果可以给田间选择带来指导作用。Herrmann等[9]利用SSR标记显示在四倍体紫花苜蓿群体中最合适样本量为 40 个基因型，能反映出这个群体的遗传多样性。遗传多样性是指基因的变化是生物个体基因中蕴藏的遗传信息的总和，遗传多样性的研究是遗传资源保存利用的前提条件[10]。本研究对评价出的耐盐材料与敏盐材料利用分子标记的方法对其遗传多样性进行比较,目的在于快速鉴定出不同紫花苜蓿品种耐盐性差异及它们之间的遗传多样性，为紫花苜蓿新品种的选育、种质资源的开发、杂交亲本的选配，分子标记的开发、耐盐相关基因的发掘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验紫花苜蓿品种材料由甘肃农业大学曹致中老师惠赠。前期从50份紫花苜蓿品种材料中通过表型鉴定的方法筛选出的5份耐盐品种、5份敏盐品种为试验材料。并根据初步筛选出品种的叶绿素含量、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性及丙二醛含量进行综合评价,依据综合评价值(D值) 对耐盐性进行强弱排序,按由强到弱排列如下：“阿迪娜”>“巨能”>“巨能7号”>“抗旱15”>“骑士T”>“Asi”>“兴平”>“秘鲁”>“草原3号”>“国产苜蓿”。每个品种随机取50个单株，共500份样品。(见表1)

表1 供试紫花苜蓿材料Table 1 Alfalfa accessions

1.2 试验设计

剪取每个供试材料的嫩叶约0.3 g，采用Plant Genomic DNA Kit(北京天根)试剂盒来提取每株材料的基因组DNA。将提取的基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

试验所用的SSR引物均从已发表的相关文献中查得[11-14]，并由上海生工技术服务有限公司合成。将每份材料的基因组DNA取等量混合，对每对引物进行梯度PCR反应扩增，将扩增产物经过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，选择具有多态性条带的引物备用。

SSR扩增反应体系为：2 μL模版，上游和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL总计25 μL体系；SSR反应扩增程序为：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，48 ℃～56 ℃退火45 s(不同引物的退火温度不同)，72 ℃延伸60 s，共35个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

将试验所得的聚丙烯酰氨凝胶电泳条带采用0/1法进行统计，构建1/0二元矩阵[15]，并计算等位基因频率，便于后期指标计算。

1.3 计算指标

(1)多态位点百分率[16]

多态位点百分率=单态位点数/总位点数；

(2)杂合度[10]

群体内某一位点的杂合度

平均杂合度

上述公式中，Pi表示某一位点上第i个等位基因频率，n为某一位点的等位基因数，hj为第j位点的杂合度，r为位点个数。

(3)香农指数(Shannon-Wiener，I)[12]

I=∑piInPi

，

上述公式中，Pi表示某一位点上第i个等位基因频率。

(4)多态信息含量(Polymorphism Information Content，PIC)[10]

多态信息含量(PIC)采用PIC-CALC软件进行计算。

(5)平均有效等位基因数[10]

PNe/A0=Ne(A0)-1

上述公式中，Pij：第i座位上第j个等位基因频率；m：第j个座位的等位基因数；Nei：第i个座位上的等位基因有效数目；n：所测座位的总数；Ao为等位基因观察数；PNe/Ao为有效等位基因数与等位基因观察数的比值，其范围为0～1。

(6)遗传分化系数(Gst)[12]

Gst=Ht-Hs(Ht)

上述公式中，Ht为材料的总基因多样性，Hs为材料内基因多样性。

(7)遗传距离(Ds)

Nei，s标准遗传距离(Nei，s standard genetic distance，Ds)[17-18]

上述公式中，xiyi表示第i条带分别在群体X，Y中出现的频率。

(8)遗传相似系数(Gs)[17-18]

Gs=1-Ds

上述公式中，Ds为Nei，s标准遗传距离。

(9)聚类分析

利用MEGA6.0软件对遗传距离(Ds)进行UPGMA聚类分析[9]。

(10)数据整理

数据整理用Microsoft Excel 2003软件，数据处理采用IBM SPSS Statistics19软件。

2 结果与分析

2.1 多态性引物

本试验共收集到了35对SSR引物，经过筛选获得具有多态性且条带清晰的SSR引物有9条，见表2。

表2 9对呈多态性紫花苜蓿微卫星引物信息Table 2 The information of 9 pairs of miscrosatellite primers with polymerp hism in alfalfa

2.2 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

部分扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱见图1。

2.2 群体内的遗传变异分析

2.2.1品种内多态位点百分率(Percentage of polymorphic loci)分析 多态位点百分率就是多态位点数占总位点数的比率，它可以反应群体遗传多样性的大小。每个扩增片段作为一个位点，对每一个位点来说当它的比率大于1%时，则此位点就是多态性位点[12]。10个紫花苜蓿品种的平均多态位点百分率统计于表3。由表3可知，10个品种中“阿迪娜”的平均多态位点百分率最高为71.80%，“秘鲁”的平均多态位点百分率最低为47.1%；10个紫花苜蓿品种的平均多态位点百分率均大于1%，所以10个紫花苜蓿品种表现出高多态性。

图1 位点AFctt1在巨能扩增检测Fig.1 Banding Patterns of AFctt1 in the alfalfa注：图中各泳道编号为巨能苜蓿单株材料编号Note:The lane Numbers are the individual plant material Numbers of Magnum

表3 10个紫花苜蓿品种群体内的遗传变异Table 3 Genetic variation in 10 alfalfa Varieties

2.2.2品种内有效等位基因数(Effective allele number)分析 有效等位基因数是反应群体遗传变异大小的一个重要指标，它能够很好的反映在群体中起作用的等位基因数目，等位基因在群体分布的越均匀，有效的等位基因数目就越接近所检测到的等位基因数的观察值[14]。

10个紫花苜蓿品种的有效等位基因数与等位基因观察数的比(PNe/Ao)统计结果见表3。由表3可知10个紫花苜蓿品种的有效等位基因数与等位基因观察数的比(PNe/Ao)范围为0.680～0.890，说明这10个紫花苜蓿品种等位基因在群体分布比较均匀；其中品种“巨能”的PNe/Ao最高为0.890，品种“草原3号”的PNe/Ao最低为0.680。

2.2.3品种内杂合度(Heterozygosity)分析 杂合度，它是反应群体在多各位点上的遗传变异，是度量群体内遗传变异的一个参数。其数值的大小反映了群体内个体的均匀度，数值越大群体内的遗传变异就越大，数值越小群体内的遗传变异就越小[10]。10个紫花苜蓿品内的平均杂合度统计结果见表3。由表3可知10个紫花苜蓿品种的平均杂合度在0.759～0.822之间，其中“巨能7号”的平均杂合度最高达到了0.828，“国产苜蓿”的平均杂合度最低为0.759；说明这10个紫花苜蓿品种的遗传变异较大，有利于对材料进行研究分析。

2.2.4品种内香农指数(Shannon Index)分析 香农指数是评价种群遗传分化的重要指标，种群内的遗传分化可用香农指数进行估算，指数越大遗传多样性越大，种群的分化程度越高[12]。

10个紫花苜蓿品内的香农指数据统计结果见表3。由表3可以看10个紫花苜蓿品种的平均香农指数在1.753～1.976之间，说明这10个紫花苜蓿品种的遗传分化程度较大；其中“巨能7号”的平均香农指数最高达到了1.976，“国产苜蓿”的平均香农指数最低为1.753。

2.2.5品种内多态信息含量(Polymorphism Information Content)分析 多态信息含量是表示微卫星位点变异程度大小的一个指标，当PIC>0.5时，则该位点为高多态性；当0.25

10个紫花苜蓿品种内的平均多态信息含量(Average PIC)统计结果见表3。由表3可以看出10个紫花苜蓿品种的Average PIC在0.735～0.811之间，10个品种的Average PIC的平均值均大于0.5，说明这9条引物可为这10个品种提供理想的信息；其中“巨能7号”的Average PIC最大为0.811，“国产苜蓿”的Average PIC最小为0.735。

2.3 群体内的遗传变异综合分析

2.3.1各单项指标及相关性分析 将10个紫花苜蓿品种的平均多态位点百分率、杂合度、有效等位基因数与等位基因观察数的比(PNe/Ao)、香农指数、PIC的平均值统计结果见表4。在将上述5个指标的平均值用IBM SPSS Statistics 19进行处理得到相关系数矩阵结果见表5。由表4可以看出各品种各指标均不相同，其中“巨能7号”的杂合度、香农指数、多态性息含量(PIC)均比其他品种高；“阿迪娜”的多态位点百分率比其他品种高；“骑士T”的PNe/Ao比其他品种高。因此用单项指标不能准确的反应出各品种内的遗传变异大小，因此需要进一步进行综合分析。由表5可以看出各指标之间存在不同程度的的相关性，说明他们之间所提供的信息发生相互重叠，需要对实验数据进一步分析。

表4 10个紫花苜蓿品种各单项指标Table 4 The single index of 10 Alfalfa Varieties

表5 10个紫花苜蓿品种各单项指标的相关系数矩阵Table 5 Correlation coefficient matrix of the single index of 10 Alfalfa Varieties

2.3.2主成分分析 对5个单项指标的遗传变异大小进行主成分分析，由表6可以看出5个单项指标浓缩为2个指标，这2个指标累计贡献率为 84.686%，说明这2个指标携带了原始数据的绝大部分信息。

表6 10个紫花苜蓿品种综合指标系数及贡献率Table 6 Comprehensive index and contribution rate of 10 Alfalfa Varieties

2.3.3隶属函数分析及权重、D值的确定 由表7可以看出，对于同一个综合指标CI2可知巨能的u(X2)最大为1，说明此品种在CI2中遗传变异程度最大。综合指标的权重(wj)分别为 0.715，0.285。其中巨能的综合指标D值最大为 0.943。

表7 10个紫花苜蓿品种各品种综合指标值、权重、u(Xj)，D值Table 7 Comprehensive index value,weight,u (Xj),D value of 10 Alfalfa Varieties

2.3.4品种内遗传变异综合评价 经主成分分析及隶属函数计算求出综合指标评价D值，由综合指标评价D值可以看出品种“巨能”内的遗传变异程度最高为0.943；品种“国产苜蓿”内的遗传变异程度最低为0.146。其它品种内的遗传变异程度大小为：“巨能”>“骑士T”>“巨能7号”> ‘Asi’>“兴平”>“阿迪娜”>“秘鲁”>“抗旱15”>“草原3号”>“国产苜蓿”。

2.4 群体间的遗传变异分析

2.4.1群体间的遗传分化 由表8可知10份紫花苜蓿材料的总基因多样性(Ht)为0.887，品种内的基因多样性(Hs)为0.799，品种间的遗传分化系数(Gst)为0.100。即有90%的遗传变异发生在品种内，品种间的遗传变异只占10%，由此说明10份紫花苜蓿材料的绝大部分遗传变异都发生在各品种的内部。

表8 10份紫花苜蓿材料间遗传分化的SSR分析Table 8 SSR genetic differention analysis alfalfa materials

2.4.2品种间的遗传距离和遗传相似性系数分析 遗传距离和遗传相似系数是衡量群体之间遗传变异的指标，它们都是基因频率的函数。遗传其中遗传相似系数是表示群体间的相似程度。由表9可知，“巨能7号”/“巨能”之间的遗传相似性系数最大为0.893，说明它们两个品种间的相似程度最高；“秘鲁”/“兴平”之间的遗传相似性系数最小为0.118，说明它们两个品种间的相似程度最低。

表9 各位点各群体的标准遗传距离(Ds)和相似系数(Gs)Table 9 Standard genetic distance (Ds) and genetic resemble coefficient of each variety (Gs)

注：上三角为遗传相似系数(Gs)，下三角为遗传距离(Ds)

Note:The genetic resemble coefficient is above diagonal and the genetic distance is below diagona

2.4.3聚类分析 聚类分析是以数学方法为基础，描述群体间关系的一种具体而形象的分析手段，在微卫星多态性分析中常用等位基因频率进行聚类分析[12]。试验常用Nei提出的遗传距离进行聚类分析，因为它在绘制系统发生树的精确性上要优于其他聚类方法。本实验采用MEGA6.0软件对Nei遗传距离进行UPGMA聚类分析，聚类结果见图2。

由图2可知，5份敏盐材料始终聚为一大类，说明它们具有较近的亲缘关系，也间接的证明了它们具有相近的耐盐特性，均表现为敏盐。耐盐材料中“巨能”和“巨能7号”始终聚为一类，说明它们的亲缘关系较近，这可能与它们拥有共同的亲本有关；“阿迪娜”和“抗旱”又聚为一类，这可能是因为“阿迪娜”和“抗旱15”的遗传背景中有部分的共同点，有较近的亲缘关系。

图2 10份紫花苜蓿材料9个微卫星标记的UPGMA系统发生树Fig.2 The UPGMA dendrogram of 9 microsatellite markers in 10 alfalfa

3 讨论

我国拥有较为丰富的苜蓿属植物资源，研究其遗传多样性可以保存利用遗传资源。在本次试验中：10份紫花苜蓿品种中平均多态位点百分率为47.1%～71.8%，所测结果与毕玉芬[10]所测的多态位点百分率接近，说明10份苜蓿材料具有比较丰富的基因变异；平均杂合度为0.759～0.828，所测结果与张阿英[12]所测的平均杂合度接近，说明10份苜蓿材料在微卫星座位为杂合子的比例高；10个品种的PIC为0.735～0.811，均大于0.7属于中高度多态，在遗传连锁分析中，PIC大于0.7的微卫星DNA为最理想的选择标记[10]；平均有效等位基因观察数与等位基因观察数的比为0.680～0.890与刘志鹏[11]所测的结果相近，反映出在群体中起作用的等位基因的比例；香农指数为1.753～1.976，表明SSR位点的不定性大。综上所述，这10份耐盐、敏盐苜蓿材料具有较高的选择潜能。

遗传分化系数(Gst)是衡量群体间在多个座位上遗传分化的指标，是品种间基因分化相对量的一个较好的测度[12]。利用RFLP和RAPD标记技术研究表明苜蓿具有非常强的杂合性，在品种内的差异性大于品种间的差异性[19]。毕玉芬等[10]通过分析北疆苜蓿属植物间的遗传结构得出：导致种群间遗传变异加大的主要原因是不同种水平上的遗传差异。本研究的10份紫花苜蓿材料各品种内平均杂合度为0.799，总群体的平均杂合度为0.887，遗传分化系数为0.100。说明这10份紫花苜蓿材料的遗传变异主要发生在各群体内部。这与毕玉芬测得基因分化系数0.103一致。

本研究依据Nei提出的一个从大量座位的基因频率数据估算个座位的平均密码子差数的统计方法[20]，计算出10份紫花苜蓿材料间的Nei遗传距离，并采用MEGA6.0软件的UPGMA聚类方法进行聚类分析结果表明：在阈值0.093处5份敏盐材料聚为一类，说明他们具有较近的亲缘关系。这可能与它们具有相似的耐盐特性有关也间接证明耐盐性评价结果的准确性；在阈值0.098处阿迪娜和抗旱15又聚为一亚类，这可能是因为阿迪娜和抗旱15的遗传背景中有部分的共同点；在阈值0.082处耐盐材料中的巨能和巨能7号始终聚为一亚类，说明它们的亲缘关系较近，这可能与它们拥有共同的亲本有关，也间接证明实验数据及算法的可靠性。

紫花苜蓿因为具有同源四倍体，异花授粉等遗传特性，使得其遗传背景复杂[11]。在本研究中，每个品种随机取样50份，样本量总体偏少，不能完全覆盖品种内的多态位点信息。同时在耐盐与敏盐品种的平均多态信息含量的比对中并没有显著差异，意味着这些SSR位点可能与紫花苜蓿其它性状相关，后续将进行SSR标记的表型关联分析。通过利用SSR分子标记技术对紫花苜蓿材料的微卫星位点的多态性分析，可快速、即时了解其遗传多样性，而确定优良育种材料的遗传背景是苜蓿育种工作的基础[21]。

4 结论

利用IBM SPSS Statistics 19软件进行综合评价，根据综合评价值(D值)对10个紫花苜蓿品种内的遗传变异程度大小排序，排列顺序为：“巨能”>“骑士T”>“巨能7号”> “Asi”>“兴平”>“阿迪娜”>“秘鲁”>“抗旱15”>“草原3号”>“国产苜蓿”；利用MEGA6.0软件对Nei遗传距离进行UPGMA聚类分析可知：5份敏盐材料始终聚为一类；“巨能”与“巨能7号”聚为一类；“阿迪娜”和“抗旱15”又聚为一类，说明他们之间有较近的亲缘关系。