光照对不同杨树保护酶活性的影响

陈 頔

(黑龙江省林业科学院，哈尔滨 150081)

试验是在东北林业大学校园内进行，5月初，试验采用小叶杨、小青杨、小黑杨杨树扦插苗，栽于塑料花盆(上口直径28 cm，下底直径22 cm，高25 cm)中，每盆1株，按株行距0.5 m×0.5 m摆放，恢复生长1个月。

试验中采用黑色尼龙网搭设遮阴棚控制光照强度，分为3个光照强度，相对光强分别相当于全光照下的25%和50%，光照强度采用TES-1335型数字照度计进行测定，分别以Ⅰ、Ⅱ表示，以100%自然光照为对照(即不遮阴)，表示为Ⅲ。在苗木栽植中，氮肥的施肥量在0.2～2 kg，按照试验栽培密度，设置氮肥的施肥量的3个水平分别为：20 g/株，60 g/株，分别以N1、N2来表示两个施肥量的处理，以不施肥为对照，表示为N0。在试验期间，氮肥(与水的比例为1∶200)分2次施入，施肥时间定为6月初和7月初，每天要保证土壤的水分充足。分别于6月30日、7月30日采集采集长势相近的杨树健康叶片，每个处理3个重复，每个重复5株。新鲜叶片充分混匀，并置于夹链袋内，低温密封保存带回实验室，-20℃冰箱冷冻保存备用。

1 仪器与药品

仪器：电子天平、台式冷冻离心机、电热恒温水浴锅、UV-9000型紫外可见分光光度计。

药品：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、过氧化氢和愈创木酚为国产药品；氮蓝四唑(NBT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲硫氨酸(Met)、核黄素(VB2)。

2 试验方法

称取1.0 g新鲜的杨树叶片，先用液氮进行冷冻，然后在研钵中充分碾碎，备用。

SOD活性的测定参照佟丽丽(2009)的氮蓝四唑染色法，略有改动。

酶液提取：冰浴条件下，加入0.05 mol/L磷酸缓冲液6 mL，充分研磨成匀装，4℃10000 rpm条件下离心10 min，上清液即为酶粗提取液。

活性测定：取5支玻璃试管，每管中加入磷酸缓冲液1.5 mL、130 mmol/LMet溶液0.3 mL、750 μmol/L NBT 溶液 0.3 mL、100 μmol/L EDTA 溶液 0.3 mL、20 μmol/L 核黄素0.3 mL以及蒸馏水0.25 mL。其中3支试管作为处理管各加入1 mL酶液，另2支试管作为对照管各加入1 mL磷酸缓冲液。充分混匀后，将1支对照试管置于暗处，其它各试管置于4000/X日光灯下反应20 min。反应结束后,以不照光的对照试管做空白，分别测定其它各管在560 nm处的OD值。

POD和CAT活性的测定参照何东明(2010)的愈创木酚法和过氧化氢氧化法，并略作修改。

POD酶液提取：加入含0.1 g PVP的磷酸缓冲液6 mL，冰浴条件下充分研磨成匀浆，4 ℃ 10000 rpm条件下离心10 min，上清液即为酶粗提取液。

POD活性测定：取1 mL愈创木酚溶液，加入100 μL酶粗提取液和2.9 mL磷酸缓冲液，30℃水浴30 min，加入1 mL H2O2立即于470 nm波长测OD值，以不加酶液为对照。

CAT酶液提取：加入EDTA磷酸酸缓冲溶液6 mL，冰浴条件下充分研磨成匀浆，4℃ 10000 rpm条件下离心10 min，上清液即为酶粗提取液。

CAT活力测定：取30 % H2O2溶液0.6 mL定容至100 mL，取1.0 mL稀释溶液加入1.9 mL蒸馏水和0.1 mL酶粗提液，于240 nm测OD值，以不加酶液为对照。

4 数据分析

用SPSS 软件计算出酶活性的平均值和标准差，采用Univariate模型对光照强度、施肥量和生长时期进行交互效应分析。以LSD(=0.05或=0.01)检验3种影响因素对不同品种的杨树之间保护酶活性的差异显著性。

由表1可知光照强度、施肥量及生长时期对杨树植株内CAT、POD和SOD活性均产生显著影响(P<0.05)。

表1 影响杨树植株内保护性酶活性的三因素方差分析

模型拟合效果较理想R2= 0.762，0.559，0.486

由表2可知CAT的活性，不同杨树树种整体上均表现为7月份>6月份，且差异显著(P<0.05)；SOD的活性，不同杨树树种均表现为7月份>6月份，在不同光照强度下，小叶杨、小青杨、小黑杨在施肥量为N0、N1的情况下6月和7月差异不显著(P>0.05)，在不施肥的情况下，小黑杨在光照强度为50%和100%的情况下、在施肥量为N2情况下，3种不同品种的杨树在光照强度为25%、50%、100%情况下均表现为6月和7月之间差异显著(P<0.05)；POD的活性，不同杨树树种均表现为7月份>6月份，且差异显著(P<0.05)。

CAT的活性，不同杨树树种整体上均表现为Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ，6月，小叶杨和小青杨在施肥量为N1的情况下表现为Ⅰ与Ⅲ和Ⅱ差异显著(P<0.05)，且Ⅰ与对照Ⅲ差异均不显著(P>0.05)，6月，小黑杨在施肥量为N1的情况下，均表现为Ⅰ与Ⅲ和Ⅱ差异显著(P<0.05)，且显著高于对照Ⅲ。6月的其余情况下及7月，3种不同品种的杨树在施肥量为N0、N1、N2的情况下，均表现为不同光照强度Ⅰ、Ⅱ之间差异显著(P<0.05)，且显著高于对照Ⅲ(P<0.05)。

SOD的活性，不同杨树树种整体上均表现为Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ，6月，小叶杨在不同施肥量N0、N1、N2情况下，小青杨、小黑杨在施肥量为N2的情况下，均表现为Ⅰ与Ⅱ和Ⅲ差异显著(P<0.05)，且Ⅱ与对照Ⅲ差异均不显著。在7月，3种不同杨树在施肥量为N2的情况下，均表现为Ⅰ与Ⅱ、Ⅲ差异显著(P<0.05)，且Ⅱ与对照Ⅲ差异均不显著。6月，小青杨、小黑杨在施肥量为N0的情况下、7月，3种不同品种的杨树在施肥量为N0、N1的情况下，均表现为Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ差异极显著(P<0.01)，且Ⅰ与Ⅱ处理组不显著(P>0.05)，它们显著高于对照Ⅲ(P<0.05)。7月小黑杨，在施肥量为N2的情况下，表现为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理组相互之间差异显著(P<0.05)。

POD的活性，不同杨树树种整体上均表现为Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ，6月，小叶杨在施肥量为N1的情况下，均表现为Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ之间差异显著(P<0.05)，且Ⅱ和Ⅲ对照组差异不显著，除此之外，6月的小叶杨在施肥量为N0、N2的情况下、7月，其余杨树在不同施肥量的情况下，均表现为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ之间差异显著(P<0.05)，且Ⅰ和Ⅱ处理组差异不显著。

不同杨树品种的保护酶活性整体上表现为差异不显著，在光照和月份一样的情况下，除了在施肥量为N2的CAT、SOD的活性显著高于N0和N1(P<0.05)，其余活性均不显著(P>0.05)。

表2 光照强度和施肥量对杨树叶片内保护酶活性的影响 (U·g-1FW·min-1, U·g-1FW)

酶SOD树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月13.1348±1.4738Aa18.0241±2.3010Ab17.2865±6.3125Ab17月17.3581±2.1472Aa110.7723±5.2985Aa18.2918±7.3124Ab1小青杨6月15.2051±2.1566Aa19.5120±3.0411Aa16.5568±7.1243Ab17月18.3541±3.5679Aa111.2031±5.3047Aa18.9912±8.3124Ab1小黑杨6月12.8345±0.3124Aa110.9167±3.3983Aa16.5625±2.6391Ab17月14.4167±1.9777Aa116.3750±8.8018Ba17.8521±8.2772Bb1

酶POD树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月43.3100±4.3672Aa125.7100±4.3315Aa119.3500±5.2783Ab17月69.6200±5.7214Ba168.1000±9.2214Ba132.4200±2.9132Bb1小青杨6月29.6500±4.4121Aa128.9000±5.8959Aa115.9100±5.5538Ab17月77.1300±5.3316Ba171.8800±9.3695Ba148.9000±3.4137Bb1小黑杨6月20.3400±3.9910Aa122.5000±3.4718Aa112.8000±6.0142Ab17月59.7800±2.3367Ba157.9700±3.1269Ba137.5600±4.3981Bb1

酶(N1)CAT树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月1.3671±0.0621Aa13.5718±0.1665Ab10.5362±0.0901Aa17月6.1578±0.0278Ba110.4319±0.9283Bb13.0012±0.1352Bc1小青杨6月1.3766±0.0779Aa14.1375±1.0263Ab10.4627±0.3005Aa17月6.2891±0.1832Ba112.3785±1.0239Bb13.9558±0.9245Bc1小黑杨6月1.3759±0.0404Aa13.7119±0.2576Ab10.5394±0.1765Ac17月6.1633±0.1450Ba111.0023±1.2259Bb13.9316±0.3382Bc1

酶SOD树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月16.1852±0.5785Aa18.1178±0.4562Ab17.3011±0.9724Ab17月14.4218±0.1552Aa110.8931±1.0279Aa18.4013±1.2264Ab1小青杨6月16.2203±1.2563Aa19.5336±0.6754Ab16.5882±1.0241Ab17月18.3712±0.8856Aa111.2189±1.0448Aa19.0576±0.8856Ab1小黑杨6月12.8526±0.6671Aa110.9341±0.8227Ab15.5908±1.0265Ab17月13.4408±1.0096Aa111.4006±1.0291Aa17.9027±0.8772Ab1

酶POD树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月43.7100±3.8912Aa125.9200±3.5672Ab122.9000±1.3425Ab17月69.8900±4.0129Ba168.4500±5.3126Ba143.6800±3.5612Bb1小青杨6月28.0200±6.1782Aa127.2100±6.7784Aa113.4000±5.1249Ab17月79.5000±4.2293Ba172.0000±5.1428Ba141.5200±7.2264Bb1小黑杨6月23.6200±2.1579Aa122.9300±1.5562Aa116.2200±4.1596Ab17月67.2200±4.5531Ba162.3500±3.7215Ba138.8800±3.1895Bb1

续表2

酶(N2)CAT树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月4.5931±0.1208Aa29.0206±0.0814Ab22.7511±0.1087Ac27月10.4782±0.0654Ba219.6548±0.4513Bb26.9685±0.2648Bc2小青杨6月4.5368±0.1083Aa29.2135±0.3064Ab22.2515±0.0538Ac27月16.7718±0.0854Ba220.2566±0.0542Bb28.0024±0.2716Bc2小黑杨6月4.4417±0.1023Aa29.1552±0.1038Ab22.3517±0.0563Ac27月15.6892±0.0882Ba220.0536±0.2773Bb26.7628±0.1725Bc2

酶SOD树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月26.8729±0.5426Aa216.4217±0.7531Ab215.9976±1.0245Ab27月31.0317±1.2543Ba222.5729±1.3325Bb221.5518±2.0419Bb2小青杨6月28.2347±1.0982Aa217.0328±1.2247Ab216.0331±1.4562Ab27月31.5832±1.5573Ba223.0591±1.3372Bb222.8947±2.0816Bb2小黑杨6月32.5528±0.8217Aa218.5894±0.8726Ab213.0928±1.4423Ab27月50.7622±1.3210Ba230.2537±1.7824Bb220.1874±3.2610Bc2

酶POD树种月份ⅠⅡⅢ小叶杨6月31.8713±0.0534Aa122.0837±0.1224Aa118.1076±0.1178Ab17月56.1932±0.1328Ba163.0345±1.2735Ba142.7997±0.3154Bb1小青杨6月22.9033±0.0564Aa119.8821±0.3217Aa111.2567±0.2297Ab17月51.3341±0.1209Ba142.5223±1.2206Ba128.5563±0.1873Bb1小黑杨6月32.9867±0.0771Aa124.5126±0.1176Aa115.3022±0.1780Ab17月63.3400±0.0091Ba159.3500±0.1517Ba128.1600±0.2218Bb1

注：表中的数据标注为平均值±标准误；同列不同大写字母表示相同施肥量和相同光照强度下不同月份之间杨树叶片内保护酶活性差异显著(P< 0.05)；同行不同小写字母表示同一月份和相同施肥量下不同光照强度之间保护酶活性差异显著(P< 0.05)；不同数字表示同一月份和相同光照强度下不同施肥量之间保护酶活性差异显著(P< 0.05)。

5 结语

不同光照和不同施肥量对保护酶活性都产生差异显著，3种不同品种的杨树在光照强度为25%、50%的情况下，CAT、SOD、POD的活性均显著高于对照条件下的活性，CAT、SOD、POD的活性均在7月份最高。CAT在25%的情况下活性最高，SOD和POD在50%的情况下活性最高。CAT、SOD、POD在施肥量为N2的情况下活性最高，表明遮阴处理和施肥会提高杨树体内保护酶活性。适度的控制光照强度和施肥量，能够显著的提高杨树属植物体内的防御蛋白活性，即光照强度为50%和施肥量为N2的情况下会显著提高杨树体内保护酶活性。

植物在长期的进化过程中，由于环境变化，结合寄主自身抗性的强弱以及昆虫的种群数量还有植物自身所含有的抗性相关物质的长期协同防御过程中的影响，形成了独特的防御体系。这些防御体系在抵御植物的病虫害过程中，常常发挥着重要的作用，其中就包括保护酶、防御酶、防御蛋白抑制剂，此外还有一些酚酸、单宁类物质。因此，深入探讨和研究植物抗性相关物质的影响因素，不仅在理论上能够认识植物与昆虫相互协作关系，还能在实践上能够补充和完善害虫综合治理的体制，为实施病虫害生物防治技术奠定了坚实的理论基础。本研究通过测定生长于不同光照强度和施肥量等环境影响因素对杨树植物防御蛋白活性的影响，系统分析和探讨光照差异和施肥差异对杨树植物的保护酶、防御酶、和蛋白酶抑制剂的含量和活力变化。