干化学法建立重庆地区健康儿童肝功能指标参考区间值的横断面调查

饶露蓓 刘来成 刘 曼 尹一兵 陈大鹏

实验室制定合适的参考区间(RI)才能为疾病诊疗提供可靠依据。实验室检测结果应参照适合的RI进行解释。然而，目前许多儿科检测项目没有已知的适合年龄和性别的RI[1]。此外，大多数RI使用已过时的检测方法获得，可能不再适用于现有检测系统[1]。实验室应定期审查和调整RI，否则会影响检测结果的准确判读。因此，有必要通过实验室现有检测系统为当地健康儿童建立适合年龄和性别的RI。目前，我国干化学法检测健康儿童肝功能指标的参考区间尚无国家标准，本实验室既往采用试剂厂家提供的成人参考区间和《全国临床检验操作规程》(第4版)。基于以上情况，本课题组参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)C28-A3文件[2]，采用干化学法建立重庆地区3月龄至18岁健康儿童8项肝功能指标的RI,为临床提供参考。

1 方法

1.1 伦理和知情同意说明 “建立儿童临床常规检验指标参考区间”方案经重庆医科大学附属儿童医院(我院)伦理委员会批准(批准文号：CHCMV-IRB-104)。肝功能检测项目为健康体检的常规项目，检测值用于本文分析未行知情同意告知。

1.2 参考个体来源及筛选

1.2.1 纳入标准 同时满足以下条件：①2014年12月1日至2018年12月31日于我院健康体检的3月龄至18岁儿童，②经体格检查未见异常，③血常规和尿常规均未见异常，④有肝功能检测值。

1.2.2 排除标准 由儿童家长在体检前完成健康问卷调查，内容包括：年龄、性别、身高、体重、体温、疾病史、用药史、手术史、有无不良饮食习惯。根据调查问卷结果，排除具有以下任意一项的儿童：①罹患肝胆疾病、心血管疾病、血液病、神经肌肉病、骨骼肌损伤、肾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病、糖尿病、佝偻病、甲状腺功能亢进或低下、甲状旁腺功能亢进症、肺栓塞、哮喘、反复呼吸道感染和肿瘤；②标本采集和检测前14 d内有用药史；③6个月内有手术史；④营养不良和消化吸收不良(腹胀、腹痛、腹泻、大便常规查见淀粉颗粒、脂肪滴)，消瘦，超重或肥胖(参照WHO标准[3, 4])，有不良饮食习惯(挑食、偏食、三餐不定)，嗜烟，酗酒。

1.3 分组 根据生长发育规律[5]和CLSI C28-A3文件[2]，按年龄分为3月龄至1岁、～3岁、～6岁、～12岁和～18岁组。

1.4 样本量 按照CLSI C28-A3文件[2]关于用非参数方法建立RI的要求，至少需要120例健康儿童，若进行分组则每组至少120例。

1.5 标本采集和检测 于清晨空腹安静状态下，采集3 mL静脉血于促凝胶管中，60 min内送至我院检验科。以 4 000 r·min-1离心8 min，剔除溶血、黄疸或脂血等不合格标本后，4 h内采用美国强生公司VITROS 5600干化学分析仪完成8项肝功能指标检测。使用仪器配套校准品、质控品和试剂。血清总胆红素(TB)、总蛋白(TP)和清蛋白(ALB)采用比色法；丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)和乳酸脱氢酶(LDH)采用速率法。

1.6 数据分析 采用SPSS 23.0软件，根据CLSI C28-A3文件[2]于2019年1月1日至2月1日进行数据分析。

1.6.1 离群值的判断 首先通过散点图和箱式图识别疑似离群值，然后根据Dixon法判断，若疑似离群值(极值)和相邻值的绝对差值≥全距的1/3，则该值被判定为离群值，需剔除该离群值所在标本的8项肝功能检测结果。

1.7 RI的验证 按照本研究纳入和排除标准，根据年龄和性别的分组情况，于2019年2月1日至2019年4月30日每组重新纳入20名参考个体(若某年龄段的RI按性别进行了划分，则该年龄段需重新纳入男、女各20名)，采集静脉血，血标本的采集、运送和检测与上述建立RI的过程一致。将验证人群所得测定值与相应年龄组建立的RI进行比对，若落在RI内的测定值个数的百分率≥90%，则该RI可以直接使用；若落在RI内的测定值个数的百分率<90%，则按照以上标准重新纳入20名，重复上述操作,若落在RI内的测定值个数百分率≥90%则RI可以使用；若落在RI内的测定值个数百分率仍<90%，则需重新检查测定程序，考虑是否存在人群差异、是否需要重新建立RI。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文纳入和排除标准3 758份血样本，剔除35份溶血、黄疸或脂血不合格标本。～6岁组ALP、～12岁组ALT和～18岁组AST的检测结果各有1个离群值，剔除这3个离群值所在标本的所有检测结果，3 720份标本检测结果进入统计学分析。3月龄至1岁组241份(男120份)，～3岁组251份(男131份)，～6岁组938份(男524份)，～12岁组1 671份(男988份)，～18岁组619份(男379份)。

2.2 8项肝功能指标检测结果 表1显示，除3月龄至1岁组总ALT、女童ALB、ALT、LDH和男童ALT、AST，～3岁组总ALT和LDH、女童ALB、ALT、AST、LDH和男童ALT,～6岁组女童LDH，～12岁组女童ALB和～18岁组ALB呈正态分布外，其余各组检测结果均呈偏态分布。～3岁组TP和ALT，～6岁组TP和AST,～12岁组TB、ALT、AST、GGT和LDH，～18岁组TB、ALB、ALT、AST、ALP、GGT和LDH男女检测结果差异均有统计学意义(P均<0.05)。～18岁组除TP外，其他7项肝功能指标中位数均为男高于女，差异均有统计学意义(P均<0.05)。不同年龄段两两比较，除3月龄至1岁与～3岁组LDH、3月龄至1岁与～6岁组ALB和ALP、3月龄至1岁与～12岁组GGT、3月龄至1岁与～18岁组GGT、～3岁与～6岁组ALP、～6岁与～12岁组TB、～6岁与～18岁组ALT、～12岁与～18岁组ALP差异无统计学意义外(P均>0.05),其余各组两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表1 3月龄至18岁健康儿童肝功能指标各年龄组男女检测结果或M(P25,P75)]

注 1)，2)和3)是指同一检测指标不同年龄段差异无统计学意义，Kruskal-WallisH检验，P>0.05；TB：总胆红素(μmol·L-1)；TP：总蛋白(g·L-1)；ALB：清蛋白(g·L-1)；ALT：丙氨酸转移酶(U·L-1)；AST：天冬氨酸氨基转移酶(U·L-1)；ALP：碱性磷酸酶(U·L-1)；GGT：γ谷氨酰转肽酶(U·L-1)；LDH：乳酸脱氢酶(U·L-1)

2.4 8项肝功能指标的年龄变化趋势 各项指标与年龄Spearman相关性分析显示，ALT、AST和LDH检测结果均与年龄呈负相关(ALT:r=-0.108，P=0.000; AST:r=-0.644，P=0.000; LDH:r=-0.524，P=0.000)。TB、TP、ALB、ALP和GGT检测结果均与年龄呈正相关(TB:r=0.217，P=0.000;TP:r=0.524，P=0.000;ALB:r=0.282，P=0.000;ALP:r=0.170，P=0.000；GGT:r=0.181，P=0.000)。

2.5 各年龄组8项肝功能指标的RI 表2显示，除～18岁组ALT、AST、ALP、GGT和LDH检测Z>Z*，男女数据不可合并外，其他各年龄段男女数据均可合并。男女数据合并后，比较相邻年龄段数据是否可以合并，发现5个年龄组ALB，～3岁、～6岁、～12岁和～18岁组TB，3月龄至1岁、～3岁、～6岁和～12岁组ALP，～3岁、～6岁和～12岁组ALT和GGT，3月龄至1岁和～3岁组ALB和LDH检测值为Z

2.6 RI的验证结果 8项肝功能指标检测结果落在RI内百分率结果显示，TB：3月龄至1岁组90%，～18岁组100%；TP：3月龄至3岁组95%，～6岁组100%，～12岁组95%，～18岁组95%；ALB：3月龄至18岁组95%；ALT：3月龄至1岁组100%，～12岁组100%，～18岁组男女均为100%；AST：3月龄至1岁组90%，～3岁组95%，～6岁组95%，～12岁组95%，～18岁组男女均为100%；ALP：3月龄至12岁组100%，～18岁组男100%、女95%；GGT：3月龄至1岁组95%，～12岁组95%，～18岁组男95%、女100%；LDH：3月龄至3岁组90%，～6岁组90%，～12岁组95%，～18岁组男女均为95%。

表2 不同年龄段8项肝功指标参考区间(P2.5, P97.5)

注 TB：总胆红素(μmol·L-1)；TP：总蛋白(g·L-1)；ALB：清蛋白(g·L-1)；ALT：丙氨酸转移酶(U·L-1)；AST：天冬氨酸氨基转移酶(U·L-1)；ALP：碱性磷酸酶(U·L-1)；GGT：γ谷氨酰转肽酶(U·L-1)；LDH：乳酸脱氢酶(U·L-1)

3 讨论

制定适合健康儿童生理发育的RI，面临多重挑战。首先，通过招募完全健康儿童来确定RI是十分困难的，尤其是新生儿和婴儿难以获得足够的血液样本。其次，儿童生理不断发展变化，必须为每个检测项目获得多个年龄段特定的RI，但目前尚不清楚如何对年龄进行合理划分。鉴于这些挑战，尝试利用医院体检健康儿童的剩余样本和LIS数据以确定RI的方法被多项研究证实可靠[7, 8]。本研究选择重庆地区至我院体检的健康儿童作为参考群体，根据生长发育规律初步划分年龄段，在抽样时，根据CLSI C28-A3文件[2]推荐的样本量，尝试确保每个年龄组男女至少有120个样本。随后，评估不同性别和年龄组间是否可以合并，以获得更准确的RI。

本研究对血清胆红素的检测结果显示，～12岁和～18岁组TB的男女检测结果差异均有统计学意义(P均<0.05)，推测随着年龄的增长，TB在男女间的生理差异可能逐渐增加。但与国内研究[9-11]报道的同年龄段男女差异均无统计学意义的结果有所不同。可能是各研究参考个体的具体纳入和排除标准不同所致：①纳入的具体年龄不同；②排除的疾病种类不完全相同。TB随年龄增长的变化趋势，不同的研究存在差异，曹科等[10]报道随年龄增长不断上升，Liu等[11]报道不同年龄段有一定的波动，TB在生命早期较高，1岁左右降至最低浓度，之后随着年龄增长逐渐增加。本研究结果显示，TB总体呈上升趋势(呈弱正相关，r=0.217，P=0.000)。这可能与各研究的样本量和年龄分布存在差异有关。本研究建立的3月龄至18岁健康儿童TB的RI与中国其他地区的研究比较，与成都[12]基本一致，但低于深圳[10]和郑州[11]的检测结果，可能是饮食、地区和环境等差异所致。

血清蛋白检测结果显示，随着年龄增长，TP和ALB水平逐渐增加，不同年龄段检测结果差异明显，但同年龄段男女差异不明显，与国内其他地区[9-11, 13]研究结果基本一致。

5项血清酶检测结果显示，除3月龄至1岁组5项血清酶指标,～3岁组AST、ALP、GGT、LDH,～6岁组ALT、ALP、GGT、LDH和～12岁组ALP的检测结果男女差异无统计学意义外，其他年龄段男女差异均有统计学意义,且均为男高于女，随着年龄增加差异增大，与国内外研究[14-16]结果一致。但同地区有研究报道学龄前期AST、学龄期AST和LDH男女检测结果差异无统计学意义[9]，可能是该研究统计资料呈正态分布，而本研究呈偏态分布的统计学差异所致。本研究相关性分析结果显示，ALT、AST和LDH检测结果均与年龄呈负相关，与中国深圳[14, 17]、北京[18]和国外[16]报道一致。但ALP和GGT随年龄增长的变化趋势，不同研究结果不同，本研究显示ALP和GGT均与年龄呈正相关(ALP:r=0.170，P=0.000；GGT:r=0.181，P=0.000)，与Wanjian等[19]和Bussler等[16]报道一致。但Liu等[11]报道GGT随着年龄增长逐渐下降，罗小娟等[14]报道ALP与年龄呈负相关(ALP：r=-0.082，P=0.000)，Higgins等[20]发现ALP仅与青春期呈负相关。推测GGT和ALP随年龄变化波动较大，而不同研究的年龄段划分存在差异，调查其适合年龄的RI需要进一步扩大样本量，进行更细致的分组。郑州地区调查了63 086例0～16岁健康儿童，发现GGT和ALP的RI需要进行8～9个年龄段的划分[11]。

本研究结果显示，除ALB外的其他肝功能指标均需要按年龄划分。～18岁组5项血清酶指标也需要按性别作进一步划分，与国内报道[11, 14]一致，青春期的男女差异可能是脂肪-肌肉分布、性激素和代谢过程之间的相互作用(如胰岛素抵抗)不同所致[21, 22]。本研究结果显示，年龄差异较性别差异显著，提示后续进行大样本的RI调查，需主要根据年龄进行划分。虽然RI需要根据统计分析结果进行细分，但尚不清楚这些统计差异是否具有临床意义。

本研究所使用的干化学法是采用美国强生VITROS 5600干化学分析仪,通过测定干片颜色变化确定化合物浓度,具有简便、快速、准确、干扰因素少及试剂保存时间长等特点,适用于儿科生化指标的检测和RI的调查[23]。与使用相同检测系统的研究结果比较，RI范围窄于成都地区[12]，推测可能是后者的研究样本量较少所致[5]。本研究结果与同地区通过湿化学法建立的学龄前期和学龄期健康儿童肝功能指标的RI存在差异[9]，可能是检测仪器、试剂、方法和原理的不同所致。因此，有必要针对不同检测系统建立各自的RI。国外有研究计划通过同一标本多系统检测比较不同检测系统的结果差异[24]，但其尚未得出研究结论。本研究所使用的试剂盒提供的成人RI：TB 3～22 μmol·L-1，TP 63～82 g·L-1，ALB 35～50 g·L-1，ALT：男21～72 U·L-1、女9～52 U·L-1，AST：男17～59 U·L-1、女14～36 U·L-1，ALP 38～126 U·L-1，GGT：男15～73 U·L-1、女12～43 U·L-1，LDH 313～618 g·L-1。与本研究干化学法建立的3月龄至18岁健康儿童肝功能指标的RI比较，血清TB、ALT、ALP、GGT和LDH检测结果与成人差异较明显，儿童ALP水平明显高于成人[9, 15, 19, 25]，可能是儿童骨骼生长迅速，骨髓中成骨细胞分泌旺盛，产生大量ALP造成[25]。

本研究的不足与局限性：①8项肝功能指标的年龄分组是根据生长发育规律统一划分的，应按照各指标随年龄变化的趋势作相应的划分，本研究样本量不够大，尚需纳入更多的参考个体，将各指标的年龄分组细化并深入研究随年龄增长的变化趋势，以建立各年龄段准确的RI；②未纳入0～3月龄健康儿童，使得儿科RI的完整性受限。应根据临床需要，纳入该年龄段人群并合理分组；③统计资料呈偏态和正态混合分布，需考虑纳入更多样本量，也可能需要重新评估参考人群的纳入和排除标准[5]。

综上，本研究基于干化学法建立了3月龄至18岁健康儿童不同年龄和性别的8项肝功能指标RI，根据CLSI C28-A3文件[2]的建议，经过进一步验证和转移后，可为其他实验室建立准确适用的生物RI提供依据和借鉴。