操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响

韩 烁，周雯慧，李 媛

（首都医科大学附属北京朝阳医院 生殖医学中心，北京 100020）

卵母细胞体外受精及胚胎发育对生长环境有严格的要求，温度是重要的一个关键影响因素[1]。人的基础体温是37°C，所以最适宜卵母细胞成熟及胚胎发育的温度是37°C。但是在卵母细胞体外受精和胚胎发育的实际操作过程中，操作环境很难保持恒定的37°C，为了保证实验室人员的正常工作环境，实验室的空气温度都低于37°C，因此培养皿离开培养箱到操作台，这个时间段中培养皿的温度会有所下降，为了减少室温对卵母细胞和胚胎的影响，操作台温度的设定就尤为重要，温度下降会影响卵子内部的一些结构变化特别是成熟过程中的卵母细胞[2]。在整个体外培养的操作中，卵母细胞的收集耗时最长，暴露在外的时间最多。常规操作台的设定温度为37.0°C±0.5°C，但是培养皿内培养液的温度受到室温和空气流动的影响，2 种因素均会降低培养皿内的液体温度。在操作台温度设定为37°C 时，在培养皿和液体的热量传递过程中会有时间耗损和热能耗损，导致培养液滴内的温度达不到37°C，提高操作台温度是否对卵母细胞的受精和胚胎发育有影响尚鲜见报道。本研究旨在探讨提高操作台的温度后对卵母细胞的受精和胚胎的后续发育的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级C57 雌性小鼠40 只，雄鼠10 只，鼠龄8～10 周，体重30～40g，小鼠由北京维通利华联合实验动物技术有限公司提供。小鼠生长环境自然光照，饲养条件为光照14h，黑暗10h，小鼠可自由饮水和摄食，适应性饲养10d 后进入实验阶段。

1.2 收集卵母细胞

实验设置4 组，每组10 只小鼠，分别为实验组1、实验组2、实验组3 和对照组。实验组1：在卵母细胞收集期和胚胎培养期，操作台温度均为38.0±0.2°C；实验组2：在卵母细胞收集期操作台温度为38.0±0.2°C，在胚胎培养期操作台温度为37.0±0.2°C；实验组3：在卵母细胞收集期操作台温度为37.0±0.2°C，在胚胎培养期操作台温度为38.0±0.2°C；对照组：在卵母细胞收集期和胚胎培养期，操作台温度均为37.0±0.2°C。分组条件可见表1。

小鼠动情周期d3 起，晨8 点腹腔注射促性腺激素释放激素激动剂（Gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa，曲普瑞林，德国辉凌公司）0.02μg/g。至动情周期d9 腹腔注射孕马血清促性腺 激 素 （pregnant mare's serum gonadotropin，PMSG）0.4IU/g，在首次注射Gn 后48h，腹腔注射绒毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin，HCG）0.4IU/g，16～18h 后颈椎脱臼法处死小鼠，无菌操作下迅速取出双侧输卵管，显微镜下观察后自膨大部一端冲洗取出卵母细胞复合物，受精液（G-IVF，Vitrolife）冲洗后培养其中。每只小鼠从取出双侧输卵管到完成收集卵母细胞复合物的时间控制在5min 内。

1.3 收集小鼠精子

采用颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下剪取双侧附睾、附睾尾及附睾尾近端输精管，每侧组织剪成4～6 块，放入受精液（G-IVF，Vitrolife）中，在37°C、6%CO2饱和湿度培养箱中培养上游20min，后去除附睾及组织块，精子继续获能1.5～2h。

表1 实验分组条件

1.4 体外受精与胚胎培养

将收集的卵母细胞按照分组进行体外培养。随后置于获能的精子微滴（10～20 个卵/100μl 的微滴，精子密度为5×105/ml）中，放置在37°C、6%CO2的饱和湿度的培养箱中培养12h，后转移至卵裂胚培养液（G-1-PLUS，Vitrolife）微滴中继续培养，48h 后转移至囊胚培养液（G-2-PLUS，Vitrolife）微滴中培养36h，观察记录全程胚胎发育情况（原核期，卵裂期，囊胚期）。

1.5 统计学处理

采用SPSS23.0 软件进行统计学分析，组内比较采用t 检验。

2 结果

2.1 操作台温度对卵母细胞受精情况的影响

胚胎培养期包括胚胎卵裂和囊胚形成。小鼠胚胎正常受精时，可在倒置显微镜下观察到两原核形成（two pro-nucleate，2PN），但是异常受精时会出现一个原核（one pro-nucleate，1PN）。实验组3 和对照组相比，小鼠卵母细胞的受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率没有差异。当卵母细胞收集的操作台温度在38.0±0.2°C 的条件下，实验组2 的2PN 率为89.82%，对照组为96.25%，且有显著性差异（P＜0.05）；实验组1 为卵母细胞收集期和胚胎培养期的操作台温度均为38.0±0.2°C，和对照组相比，1PN 形成率显著升高（表2）。

表2 操作台不同温度下小鼠卵母细胞受精及胚胎发育情况 n（%）

2.2 操作台温度对胚胎卵裂情况的影响

实验组1 的胚胎卵裂率为31.61%，显著低于对照组 （P＜0.05）。实验组2 的胚胎卵裂率为40.01%，小于对照组，但无显著性差异；实验组3和对照组相比胚胎卵裂率相似（表2）。

2.3 操作台温度对囊胚形成率的影响

实验组1、2 的囊胚形成率分别为44.18%和41.66%，均显著小于对照组的囊胚形成率57.50%（均P＜0.05）。实验组3 的囊胚形成率与对照组相比无显著性差异（表2）。

3 讨论

卵母细胞的体外操作包括3 个过程，37°C 的培养箱（人体）到室温，室温到操作台，再从操作台进入室温后进入37°C 的培养箱。整个过程中减少温度的波动程度非常重要。操作台的加热装置不是恒定的，同一加热台的不同点温度会有差异，因此最适合的温度范围是研究的重点。许多研究中心认为在层流和培养皿的隔离作用下，为了保证培养滴的温度达到37°C，需要将操作台的温度提高至37.5°C 甚至38°C，因此为了探究是否提高操作台温度有助于卵母细胞的受精和胚胎的发育，我们设立了37.0±0.2°C 和38.0±0.2°C 为自变量，考虑到卵母细胞和胚胎具有不同的结构和生理特性，我们在时间上划分了2 个时期，卵母细胞收集期和胚胎培养期。在本次研究中我们发现，卵母细胞收集期的操作台温度升高1°C，对小鼠卵母细胞的受精、胚胎卵裂和囊胚形成有显著影响。胚胎卵裂和囊胚形成期的操作台温度升高1°C，对胚胎正常卵裂和囊胚形成无影响。

卵母细胞收集期操作台温度提高至38°C 并没有增加卵母细胞正常受精率，反而将低了2PN形成率，提高了异常受精率，同时胚胎培养期的操作台温度升高至38°C 对胚胎正常卵裂和囊胚形成无影响。这个研究结果充分说明为了减少卵母细胞和胚胎的体外操作温度损失而提高操作台的温度对卵母细胞的受精、胚胎发育不仅没有益处，反而会影响卵母细胞正常受精和胚胎发育。

因为卵母细胞在成熟过程中，温度的变化对卵母细胞的成熟和后期胚胎发育都会产生影响，有文献报道环境温度的升高会对纺锤体的形态造成干扰，细胞内微管在温度的升高下聚集，过高的温度会破坏纺锤体的形态，对卵母细胞造成不可逆的影响[3，4]。

尽管本项研究采用的模式动物为小鼠，但是其他猪卵母细胞相关研究结果也获得了类似的结论。Hunter 等人测定猪的卵泡发育和体内温度时发现，猪卵泡内的温度要低于37°C，因此建议在卵母细胞收集过程中降低操作时的温度[5]。2018年文献报道了比较牛卵母细胞在36.5°C 和38.5°C 不同的培养环境中，卵母细胞的受精和胚胎发育情况，研究结果表明在36.5°C 的培养环境中牛卵母细胞获得了更好的成熟及后续胚胎发育[6]。另一项研究表明，在牛卵巢中，卵泡液温度较低的卵泡中的卵母细胞可能发育得更成熟[7]。在本项研究中，操作台温度设定为36°C 时小鼠卵母细胞的受精及胚胎发育情况未涉及，在下一步的研究中会继续探索。