阿托伐他汀对慢性肾病大鼠血清及肾组织microRNA-92a 表达的影响＊

赵婷婷，郭娟英，尚粉青，王 慧，程曼丽，郭 瑄

在慢性肾病发展过程中硫酸吲哚酚、 吲哚乙酸、 马尿酸等尿毒症毒素均可以诱发microRNA-92a（miR-92a）升高，miR-92a 影响内皮细胞重要调节因子Krüppel 样转录因子2 （Krüppel-like factor 2，KLF2）、Krüppel 样 转 录 因 子 4 （Krüppel-like factor 4，KLF4）、 沉 默 信 息 调 节 因 子-1（silent information regulator of transcription-1，SIRT1）等的表达，从而诱发内皮细胞炎症反应，损伤内皮细胞功能［1］。 有报道阿托伐他汀可以降低miR-92a 的表达［2］，该研究目的在于观察阿托伐他汀是否可以降低慢性肾病的炎症反应及其是否通过降低miR-92a 发挥治疗作用。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器阿托伐他汀购自辉瑞制药有限公司。 主要试剂：PCR 引物 （miR-92a、KLF2等）：生工（上海）有限公司合成。 β-actin 抗体购自Santa Cruz 公司；KLF2 抗体购自美国Cell Signaling公司。Trizol 试剂（Invitrogen 公司），HiScriptTMqPCR SuperMix 逆转录试剂盒 （Vazyme 公司），PCR DNA聚合酶（Vazyme 公司），其余试剂为国产分析纯。 主要仪器： 实时定量PCR 仪及梯度PCR 仪 （美国Applied Biosystems 公司），WB 电泳仪和电泳槽、WB 半干转膜槽（BIO-RAD 公司），自动洗片机（柯达公司）。

1.2 5/6 肾切除慢性肾衰模型的建立选用24 只8～10 周SPF 级雄性SD 大鼠作为研究对象， 购自西安交通大学实验动物中心。 所有大鼠均在室温24 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗，充足水供和饲料。二步法建立5/6 肾切除模型， 以10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧固定在手术台上，局部剪毛，右侧腹直肌外缘常规消毒，无菌操作下垂直切口开腹，长约3 cm，暴露右肾，分离固定，按上极、下极弧形切右肾组织，主要切皮质，用喷有凝血酶的凝胶海绵压迫止血，待血止后缝合包扎，切除的右肾组织约占一侧肾脏皮质的2/3。 术后2 周再次手术，同样方案麻醉，切开左侧腹部皮肤，暴露左肾，结扎肾蒂，切除左肾。 假手术组制备方法：同样方法麻醉及开腹，不切除肾脏，分离肾周膜，保留肾上腺即关腹。

1.3 动物分组及处理24 只10 周左右SD 大鼠，适应环境1 周，随机分成三组：对照组（假手术组，8只），肾病组（5/6 肾切除组，8 只）；阿托伐他汀干预组（5/6 肾切除+阿托伐他汀，8 只）。阿托伐他汀给予6 mg/kg·d 水悬液灌胃， 对照组和模型组每天给予等量的生理盐水灌胃。 大鼠自由进食、饮水。 术后8周处死动物，留取标本。

1.4 标本的采集处死大鼠前1 d， 将大鼠置金属代谢笼，留取24 h 尿液。 测定24 h 尿蛋白定量。 处死大鼠当天用10%水合氯醛麻醉大鼠，取腹腔正中切口，经腹主动脉采血，提取血清，测定血生化。 取肾脏组织（对照组取右肾中极肾组织，肾病组取剩余的肾组织） 分成1 cm3大小置一80 ℃冰箱保存，用于分子生物学研究。

1.5 血清各项指标的测定用血自动生化仪测定血尿素氮、肌酐、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。 采用RT-PCR 方法测定血清中miR-92a 的含量，具体方法见文献［3］。使用ELISA 试剂盒测定血清中hs-CRP 及IL-1β 水平变化。

1.6 肾脏组织各项指标的测定（1） 取肾脏组织50 mg，剪碎，加入Trizol 1 ml超声匀浆，提取肾脏组织RNA，RT-PCR 方法测定肾脏组织中各因子的表达变化。 PCR 引物序列见表1。 （2）取肾脏组织80 mg/只，剪碎组织，加入蛋白裂解液约300 ml，匀浆机匀浆，3 次，30 s/次； 液氮冻融3 次，4 ℃，12000 r/min， 离心15 min， 取上清，ABC 法测定蛋白浓度。Western Blot 方法测定肾脏组织中蛋白表达的变化。

表1 实时定量PCR 引物列表

1.7 统计学分析计量资料用均数±标准差表示，两组比较采用t 检验；计数资料用百分比（%）表示，比较采用λ2检验，相关分析采用Spearman。 正态性检验采用Shapiro-Wilk 检验， 方差齐性检验采用Levene 检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清中miR-92a 含量变化如图1 所示，与正常对照组相比，肾病组大鼠血清miR-92a 水平显著升高 （肾病组值5.181 vs. 对照组值1.134，P＜0.01）。 阿托伐他汀治疗组血清miR-92a 水平较肾病组明显降低 （他汀治疗组值2.250 vs. 肾病组值5.181，P＜0.05）。

图1 三组大鼠血清中miR-92a 含量变化

2.2 血清中一般生化指标及CRP 及IL-1β 等炎症指标变化与正常对照组相比，肾病组尿素氮和肌酐明显升高，血浆总胆固醇（TC）（P＜0.01）及低密度脂蛋白（LDL-C）亦显著升高（P＜0.05）。 阿托伐他汀治疗组与肾病组比较，TC 和LDL-C 降低 （P＜0.01），尿素氮和肌酐明显降低，两组比较差别有统计学意义 （P 值分别＜0.05 和＜0.01）。 但三酰甘油（TG）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平在治疗前后无明显变化（P＞0.05）。炎症指标CRP 及IL-1β 在肾病组明显升高（P＜0.01），阿托伐他汀治疗后明显降低（P＜0.05）。 见表2。

表2 三组血清生化指标的比较

Spearman 相关分析显示，血清中miR-92a 的水平与血清中炎症指标CRP 及IL-1β 具有明确的相关性，呈显著正相关。 见图2。

图2 血清中miR-92a 与CRP 及IL-1β 相关性分析

2.3 肾脏组织中miR-92a 及其下游靶基因KLF2表达变化RT-PCR 结果提示肾病组肾脏组织中miR-92a 表达较对照组明显增加（P＜0.01），而阿托伐他汀治疗组较肾病组表达明显减少 （P＜0.05）。RT-PCR 及Western Blot 结果提示肾病组肾脏组织中KLF2 表达较对照组明显减少（P＜0.01），而阿托伐他汀治疗组较肾病组表达明显增加（P＜0.05）。 见图3。

图3 肾脏组织中miR-92a 与KLF2 表达变化

3 讨 论

慢性肾病（CKD）严重危害着全世界人民的健康与生命。 国内外有关资料表明，慢性肾病的发病率、患病率以及患者知晓率迅速上升［4］。这已成为当今肾病专业以及医学界面临的严峻公共卫生与医疗问题。 因此寻找有效的治疗方法刻不容缓。

microRNA 在慢性肾病中的研究日益深入，已发现有多种microRNA 参与肾病的发生及发展［5-9］。miR-29、miR-302、miR-192 和miR-21 在慢性肾病发病过程中均发挥重要作用。 miR-92a 是内皮细胞特异性高表达的microRNA， 属于miR17-92 基因簇，是第一个被发现的癌基因，其表达上调被证实与多种肿瘤的发生和进展有关。 我们前期研究证实慢性肾病患者血清miR-92a 显著升高，损伤血管内皮细胞，促进心脑血管并发症发生。而对于miR-92a在肾功能损伤的进展过程中的作用尚不清楚。 该研究证实在5/6 肾切除模型大鼠的血清及肾脏组织中miR-92a 的表达均明显增加。

慢性肾病进展过程中，在各种致病因素的作用下，炎症细胞和肾固有细胞（如系膜细胞、内皮细胞和上皮细胞）合成和分泌多种炎症介质参与炎症反应，在肾病发生、发展中起了关键作用。 因此抑制炎症反应对延缓肾病的进展有重要的意义。 miR-92a通过作用于其靶基因KLF2［10］来调节炎症反应。KLF2 受血流切应力诱导，参与调节炎症、凝血、血管舒缩和血管生成等多种过程。KLF-2 通过抑制炎症关键通路核因子-kappa B （nuclear factor-κB，NF-κB） 和转录因子活化蛋白-1 （activator protein 1，AP-1）的转录活动，进而抑制单核细胞炎症因子的表达［11］。KLF2 还能抑制蛋白激酶活化受体-1，抑制凝血酶诱导的MCP-1、IL-6 和IL-8 的表达［12］。此外KLF2 还能抑制IL-1β 和TNF-α 等促炎因子诱导内皮细胞活化和内皮细胞黏附分子如E-选择素、血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1 的表达，从而抑制炎症细胞黏附［13］。

阿托伐他汀首先是通过纠正脂代谢紊乱来减轻高脂血症对肾脏的损害。 阿托伐他汀的肾保护作用机制亦可通过非依赖降脂作用机制参与：抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、减少细胞外基质、抗炎作用及调节免疫功能等。 阿托伐他汀可以通过抑制炎症因子的表达、炎症细胞的活化等起抗炎作用来延缓CKD 的进展。有研究证实他汀类药物治疗可显著降低冠心病患者血清miR-92a 水平［2］。 该研究提示，阿托伐他汀可能通过抑制miR-92a 的表达， 促进KLF2 表达增加，从而有效抑制炎症反应，延缓慢性肾病的进展。

通过该研究笔者证实了miR-92a 在CKD 进展过程中的重要作用及阿托伐他汀通过抑制miR-92a 的表达，减轻炎症反应，延缓肾病发展。而miR-92a 在肾病进展中是否有其他作用机制有待于进一步研究。动物实验证明miR-92a 抑制剂可延缓动脉硬化的发展。 而miR-92a 抑制剂是否可作为CKD的治疗方法仍有待进一步评估及验证。