微波预处理法制备茶粕基有机药肥工艺研究

胡福田　周红军　徐华　周新华　戴修纯

摘要：以油茶饼粕为原材料，采用微波预处理法，以水作提取溶剂，通过单因素试验研究液固比、温度、时间和pH值对油茶饼粕中茶皂素、蛋白质提取率的影响，并采用正交试验确定最佳提取工艺条件。结果表明，在液固比为 7 mL ∶1 g，浸提时间为2.5 h、pH值为10、浸提温度为65 ℃时，茶皂素的提取率可达13.93%，蛋白质提取率可达6.92%。

关键词：油茶饼粕;茶皂素;蛋白质;微波;浸提工艺

中图分类号：S141.9 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）19-0295-04

收稿日期：2018-07-03

基金项目：广东省科技计划（编号：2014A020208127、2017A04045053）;广东省农业厅科技计划（编号：2017LM4177）。

作者简介：胡福田（1968—），男，博士，副教授，主要从事精细化工类和农副产品综合利用研究。E-mail：hftian2002@163.com。

为了减轻化学农药和化肥造成的污染，实现2020年农药化肥零增长的目标，植物源有机药肥的研究与开发成为当前热点[1-4]。茶粕中含有12%～18%茶皂素、7%～12%蛋白质以及氨基酸、多糖等物质，是一种非常有市场与应用前景的植物源有机药肥[5-7]。在实际生产中，茶粕基本上是直接被使用，有效成分利用率低，药效、肥效差。因此，亟需将茶粕有效成分提取出来使用，以提高其利用率，增强其药效和肥效。但一般用热水浸提茶粕时，茶皂素浸提率低[8]，且水性茶粕提取液性能不稳定，茶粕中的水解酶可导致茶皂素水解沉淀[9]，茶粕中的霉菌易引发浸提液霉变腐败变质，这是限制其作为药肥使用的技术难题。

微波具有热效应和非热效应等多种特性。微波热效应可导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能，使胞内温度迅速上升，水汽化后将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，使表面出现裂纹，此时胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内物质[10-11];微波非热效应则可杀菌除酶。本研究先用微波预处理茶粕粉末来破壁杀菌除酶，再通过热水浸提制备茶粕基植物源有机药肥，以期为茶粕综合利用提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶饼粕由广东省梅州市梅江区富强客家特产经营部提供，茶皂素标准样品购于上海博蕴生物科技有限公司。生化试剂牛血清蛋白为标准样品;酒石酸钾钠、五水硫酸铜、碘化钾、氢氧化钾、盐酸、无水乙醇、硫酸、香草醛均为分析纯。

所用仪器为PHS-3C型数显精密酸度计、RE-85Z型旋转蒸发器、HH-1型电热恒温水浴锅、DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱、DZG-6020型真空干燥箱、VIS-7200型紫外可见分光光度计、G8023CSL-K 3型微波炉（格兰仕）、HJ-3 型数码恒温磁力搅拌器。

1.2 试验方法

1.2.1 原料微波预处理

油茶粕饼干燥后，粉碎，过300目筛，取筛过物进一步干燥至含水量为4%。精确称量20 g粉末，以800 W功率微波处理150 s。

1.2.2 热水浸提制药肥

对微波处理过的粉末按某一液固比、温度、时间、pH值浸提，浸提后过滤，滤液加盐酸调pH值为5.2，在真空（真空度0.09）、温度为70 ℃条件下浓缩得到提取液，备用。

1.2.3 茶皂素的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制

精确称取茶皂素标准样品 0.1 g，用80%乙醇溶液溶解并定容至100.00 mL，摇匀，配制成1.0 mg/mL溶液。分别取标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置于10 mL容量瓶中，并加80%乙醇分别将体积补充至1.0 mL，再分别加入8%香草醛乙醇溶液 1.0 mL，将容量瓶移至冰水中，用77%硫酸水溶液定容，摇匀，于60 ℃下加热30 min，进行显色反应;然后置于冰水中冷却10 min，取出置于室温下，以第1支容量瓶作空白对照，于550 nm下测吸光度。

1.2.3.2 样品的测定

将“1.2.2”节中待测滤液稀释为含茶皂素量在0.7 mg/mL左右的样品溶液，精密吸取1.0 mL，置于10 mL具塞磨口试管中，根据标准曲线的测定方法，测定吸光度，根据标准曲线计算样品中茶皂素的含量，进而计算茶皂素提取率，其公式如下：

茶皂素提取率=（浸提液中茶皂素质量/原料质量）×100%。（1）

1.2.4 蛋白质的测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制

双缩脲试剂的配制：准确称取 4.00 g 五水硫酸铜、2.49 g碘化钾、28.00 g氢氧化钾、10.00 g 酒石酸钾钠，分别溶解于蒸馏水中，定容到1 000 mL。按照牛血清蛋白试剂标签中给出的蛋白质含量，计算称样量后，准确称取牛血清蛋白，以28 g/L氢氧化钾水溶液配制成含量约为4 mg/mL的蛋白质标准溶液。分别取蛋白质标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于10 mL具塞比色试管中，用蒸馏水补齐至1.0 mL，然后向各比色管中加入 4.0 mL 双縮脲试剂，混匀，室温（25 ℃）下反应30 min。以第1支试管作空白对照，在540 nm波长测定吸光度。

1.2.4.2 样品的测定

将“1.2.2”节中待测滤液稀释为含蛋白质量在1.5 mg/mL左右的样品溶液，精确吸取1.0 mL，置于10 mL具塞磨口试管中，根据标准曲线的测定方法，测定吸光度，根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量，进而计算蛋白质提取率，其公式如下：

蛋白质提取率=（浸提液中蛋白质质量/原料质量）×100%。（2）

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

以茶皂素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图1），得到的曲线回归方程为y=0.969 7x+0.005 3，其相关系数为r2=0.999 8。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线（图2），得到的曲线回归方程为y=0.281 1x+0.003 5，其相关系数为r2=0.999 9。

2.2 微波预处理对工艺特性的影响

取“1.2.1”节微波处理粉末10 g，同时取未处理粉末10 g为空白对照，分别在相同条件下（温度60 ℃、液固比 7 mL ∶1 g、pH值10、2.5 h）浸提，其浸提液过滤特性、霉变特性、稳定性以及茶皂素、蛋白质的提取率如表1所示。

由表1可知，微波处理粉末的茶皂素提取率高于未处理粉末，其原因主要是微波热效应导致细胞内的水汽化，将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，使细胞表面出现裂纹，浸提时热水容易进入细胞内溶解胞内物质。同时，微波热效应和非热效应都有可能使某些蛋白质变性，改变蛋白质结构，使水溶性蛋白质减少，蛋白质提取率降低;但微波处理避免了水溶性蛋白质形成胶体溶液，使浸提后液固分离的处理（过滤）变得简单。同时微波处理杀死了茶粕中的霉菌，并使茶皂素水解酶失活，达到了较理想的处理效果。

2.3 浸提时间对提取率的影响

在浸提液固比为6 mL  ∶1 g、pH值为10、浸提温度为 60 ℃ 的条件下，考虑不同浸提时间对茶皂素和蛋白质提取率的影响，结果如图3所示，在浸提1 h时，提取率较低，随着时间的增加，提取率首先明显提升，这是由于浸提时间少时，浸提溶剂与茶粕粉末接触的时间短，浸提溶剂还没完全将茶皂素和蛋白质充分溶出。浸提在2 h以后，蛋白质的提取率基本保持不变，水溶性蛋白质接近溶解平衡，茶皂素的提取率还有少量的提升。由于茶粕粉末内部溶质的溶解及扩散都需要一定的时间，所以延长提取时间有利于茶皂素提取完全，提取率会相应有所提高。但是，随着时间的继续增加，液相主体溶质的浓度增加，传质推动力减小，提取的速度下降，使得生产能力降低。所以选择2～3 h作为后续试验的提取时间。

2.4 浸提温度对提取率的影响

在浸提液固比为6 mL  ∶1 g、pH值为10、浸提时间为2 h的条件下，考虑不同浸提温度对茶皂素和蛋白质提取率的影响，结果如图4所示，随着温度的升高，茶皂素和蛋白质的提取率首先有明显提升。至60 ℃以后，茶皂素提取率稍有降低，由于温度升高，茶皂素的溶解度增加，浸提液中的茶皂素浓度有所增加，同时温度的升高会使溶液的黏度下降，扩散系数增大，这有利于茶皂素的浸出。但是，当浸提温度超过 60 ℃ 时，蛋白质的提取率明显下降，可能是由于蛋白变性析出导致的。所以选择55～65 ℃作为后续试验的温度范围。

2.5 浸提液固比对提取率的影响

在浸提时间为2 h、pH值为10、浸提温度为 60 ℃ 的条件下，考虑不同浸提液固比对茶皂素和蛋白质提取率的影响，结果如图5所示，在液固比较小的情况下，茶皂素和蛋白质的浸取率较低，随着液固比的增加，提取率逐渐增加，这是因为随着液固比的增大，浸提溶剂的量增多，达到溶解平衡时会有更多的蛋白质和茶皂素被提取出来。在液固比较大的情况下，因为蛋白质和茶皂素已基本溶出，且随着液固比的增加，提取率增长很少，而后续浓缩的工作量和能耗增加很多。所以选择（6～8） mL ∶1 g作为液固比参数范围。

2.6 浸提液pH值对提取率的影响

在浸提液固比为6 mL  ∶1 g、浸提时间为2 h、浸提温度为 60 ℃ 的条件下，考虑不同浸提液pH值对茶皂素和蛋白质提取率的影响，结果如图6所示，茶皂素的提取率首先随着提取液pH值的逐渐增大而增大，在pH值为10.0时，提取率达到最大，随后呈下降趋势。其原因在于茶皂素溶液的pH值为5.5～6.5，偏酸性;当提取液偏碱性时，更容易使茶皂素从茶粕粉末中释放到提取液中，但是当pH值过大时，茶皂素在碱性条件下会发生水解，反而使提取液中茶皂素含量降低。随着pH值的增大，蛋白质的提取率首先增高，当pH值大于10.0时，提取率趋于平缓，或有所降低。理论上讲，在碱性范围内，pH值越高，蛋白质溶出率越高，但是碱性过强会引起蛋白质极端变性，团聚沉降，使水溶性蛋白质含量降低;同时部分蛋白质会发生水解。因此，选择pH值为9～11作为后续试验的pH范围。

2.7 正交试验优化结果与分析

通过对各单因素试验结果的分析，得到正交试验的各因素取值范围。综合考虑，选择浸提时间、液固比、温度、pH值4个因素进行正交试验，设计3个水平，因素水平见表2，正交试验结果见表3。

根据正交试验结果可知，影响茶皂素、蛋白质提取率因素的主次是不相同的，各因素对茶皂素提取率的影响程度按照R值从大到小依次是pH值>液固比>温度>时间，各因素对蛋白质提取率的影响程度按照r值从大到小依次是pH值>液固比>时间>温度，其中pH值和液固比对茶皂素、蛋白质的提取率影响较大，温度和时间的影响较小;茶皂素与蛋白质提取的最佳组合条件均为A2B2C2D3，即液固比为 7 mL ∶1 g、浸提时间为2.5 h、pH值为10、温度为65 ℃。对提取率最佳组合进行验证发现，茶皂素提取率为13.93%，蛋白质提取率为6.92%。

3 结论

本研究采用微波预处理法制备茶粕基植物源有机药肥。通过对比试验得出，茶粕粉经过微波预处理后，热水浸提时茶皂素提取率增加，蛋白质提取率略微减少，但改善了过滤操作，产品不会霉变、稳定性好。通过4个因素的单因素试验和正交试验得出，茶皂素与蛋白质提取的最佳组合条件均为液固比7 mL ∶1 g、浸提时间2.5 h、pH值10、温度65 ℃。通过验证表明，在最佳条件下，茶皂素提取率为13.93%，蛋白质提取率为6.92%。该工艺为茶粕综合利用提供了新的途徑。

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