4种黏土对饲用植酸酶的吸附特性
2019-12-16刘永红孔晶杨志鹏
刘永红 孔晶 杨志鹏
摘要：通过振荡吸附试验，考察了振荡时间、振荡速度、pH值和黏土添加量等因素下，沸石粉、蒙脱石、酸化凹凸棒土和凹凸棒土对饲用植酸酶的吸附动力学和等温吸附特性。结果表明：饲用植酸酶能够在60 min中内快速吸附，120 min 内达到吸附平衡;振荡速度为150 r/min时，4种黏土对饲用植酸酶吸附率达到最大，分别为：沸石粉31%，蒙脱石48%，酸化凹凸棒土53%，凹凸棒土35%。随着pH值由2增至8，4种黏土对饲用植酸酶的吸附率逐渐减小。4种黏土对饲用植酸酶的吸附动力学过程均符合准二级动力学模型。Langmuir模型对沸石粉、蒙脱石和凹凸棒土等温吸附过程拟合程度较高，Freundlich模型对酸化凹凸棒土等温吸附过程拟合较好。
关键词：沸石粉;蒙脱石;酸化凹凸棒土;凹凸棒土;饲用植酸酶;吸附
中图分类号：S816.7 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）19-0194-06
收稿日期：2018-08-16
作者简介：刘永红（1992—），女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向为应用化学。E-mail：2396551894@qq.com。
通信作者：孔 晶，博士，教授，主要从事黏土在饲料中的深加工。E-mail：cpukj@163.com。
沸石粉、蒙脱石、凹凸棒土为常用的天然矿物质饲料，最开始作为制粒的黏合剂用于畜牧业，由于其比表面积和阳离子交换能力而对有机质存在较强的吸附作用，后来用作促进动物生长的饲料添加剂及选择性吸附剂[1]。植酸酶即肌醇六磷酸水解酶，可以促进饲料中植酸水解吸收，从而降低外源性磷的添加，减少养殖业中磷的排放，降低环境“磷”污染[2]。饲用植酸酶是植酸酶的常用酶制剂，其原料组成含有黑曲霉或毕赤酵母、葡萄糖等，属于微量添加剂。黏土与饲用植酸酶均是饲料中常规的原料，已有的研究多关注蒙脱石对植酸酶纯品的吸附特性[3]，凹凸棒土与沸石粉等其他黏土对植酸酶的吸附特性研究鲜有报道。且饲用植酸酶是复合制剂，其制剂内的其他成分是否影响饲用植酸酶的吸附特性还鲜有报道。本试验选择饲料中常见的4种黏土为吸附载体，通过振荡吸附试验研究这4种黏土对饲用植酸酶吸附动力学和等温吸附特性，为探讨两者在饲料中如何高效利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
凹凸棒土、蒙脱石和沸石粉，购于江苏华正矿产品有限公司;饲用植酸酶，购于广东溢多利生物科技股份有限公司;牛血清蛋白，购于北京索莱宝生物科技有限公司;乙酸钠、乙酸、植酸钠、硝酸、钼酸铵、偏钒酸铵、磷酸、盐酸、硫酸、考马斯亮蓝G250、95%乙醇、柠檬酸、磷酸氢二钠等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
UV-2100PC紫外可见分光光度计，购于优尼科（上海）仪器有限公司上海丹鼎国际贸易有限公司;防水型笔试pH/℃测定仪，购于杭州汇尔仪器设备有限公司;CH88-1数显大功率恒温磁力搅拌器，购于苏州国华仪器有限公司;THZ-22台式恒温振荡器，购于太仓文尔惠金仪器有限公司;高速离心机，购于深圳市亿天净化技术有限公司;高速分散机，购于上海沐轩实业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 黏土的预处理
将沸石粉、蒙脱石和凹凸棒土原土加入一定量去离子水，制成质量分数约20%～25%的混悬液，高速打浆（10 000 r/min，30 min），浆料沉降后，离心（10 000 r/min，15 min），除去粗颗粒物质，剩余部分置于烘箱中烘干，研磨粉碎，过200目筛，备用。以上操作于2018年4月19—23日在淮阴工学院实验室完成。
酸化凹凸棒土：取上述提纯后的凹凸棒土按照固液比 3 g ∶1 mL（纯化凹凸棒土与硫酸溶液比）加入质量分数为25%的硫酸溶液，于80 ℃下活化2～3 h，漂洗至pH值为4～5，离心，除去上层水溶液，烘干，研磨粉碎，过200目筛，备用。以上操作于2018年4月24—27日在淮阴工学院实验室完成。
1.2.2 标准曲线的绘制
称取50 mg牛血清蛋白（精确至0.000 1 g）于烧杯中，加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（20.55 g无水乙酸钠溶解于900 mL去离子水中，用乙酸调节pH值至5.5，定容至1 000 mL）溶解，移至50 mL容量瓶中，定容至刻度。取1 mL牛血清蛋白标准母液，按照倍比稀释法稀释至0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL，各取1 mL，加入4 mL考马斯亮蓝G250染色剂（100 mg考马斯亮蓝G250溶解于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，加去离子水稀释，定容至1 000 mL），混匀，放置10 min，于 595 nm 处测吸光度[4]，不加牛血清蛋白溶液为空白对照。以D595 nm对牛血清蛋白溶液浓度作图，绘制标准曲线。以上操作于2018年5月7—8日在淮阴工学院实验室完成。
1.2.3 试验方法
饲用植酸酶含量测定：称取1 g饲用植酸酶制剂，加入100 mL pH值5.5乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌30 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，按考马斯亮蓝G250染色法，测上清液中饲用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月9日在淮阴工学院实验室完成。黏土添加量影响试验：分别称取0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 g黏土，加入 30 mL、pH值5.5的饲用植酸酶溶液，恒温25 ℃、150 r/min振荡120 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，按照考馬斯亮蓝G250染色法，测上清液中的饲用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月11—18日在淮阴工学院实验室完成。
振荡速度影响试验：室温下，在30 mL、pH值5.5的饲用植酸酶溶液中，分别加入0.5 g黏土，恒温25 ℃，振荡速度取50、100、150、200 r/min，振荡120 min，4 000 r/min离心 15 min，取上清液1 mL，按考马斯亮蓝G250染色法，测上清液中饲用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月21—24日在淮阴工学院实验室完成。
pH值影响试验：称取0.5 g黏土，加入10 mL饲用植酸酶溶液，用缓冲液调节pH值为2、3、4、5、6、7、8，恒温25 ℃，150 r/min，振荡120 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液 1 mL，按照考马斯亮蓝法G250染色法，测上清液中饲用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月25—31日在淮阴工学院实验室完成。
吸附动力学试验：称取0.5 g黏土，加入30 mL、pH值5.5的饲用植酸酶溶液，恒温25 ℃，150 r/min，于5、10、20、30、40、50、60、90、120、150 min取样，4 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，按照考马斯亮蓝G250染色法，测上清液中饲用植酸酶蛋白含量，绘制吸附动力学曲线。以上操作于2018年6月9—23日在淮阴工学院实验室完成。
等温吸附试验：称取黏土0.5 g，加入30 mL、pH值5.5的不同浓度的饲用植酸酶溶液，恒温25 ℃，150 r/min，振荡 120 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，按照考马斯亮蓝G250染色法，测上清液中饲用植酸酶蛋白含量，绘制等温吸附曲线。以上操作于2018年6月25日至7月13日在淮阴工学院实验室完成。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
如图1所示，牛血清蛋白溶液与吸光度呈线性关系，其线性方程为y=5.517 05x+0.076 53，r2=0.999 62。
2.2 振荡速度对黏土吸附饲用植酸酶的影响
由图2可知，随着振荡速度的增加，黏土与饲用植酸酶的接触更加充分，吸附率随之增加。在振荡速度在50 r/min时，蒙脱石、凹凸棒土和酸化凹凸棒土对饲用植酸酶仍有较大的吸附率，其中酸化凹凸棒土对饲用植酸酶的吸附率最大，达到20%，但沸石粉对饲用植酸酶的吸附率远小于其余3种黏土，只有7%。随着振荡速度增加，尤其在150 r/min时，4种黏土对植酸酶的吸附率达到较大水平，沸石粉28%，蒙脱石49%，酸化凹凸棒土54%，凹凸棒土35%。在200 r/min时，蒙脱石与酸化凹土棒土对饲用植酸酶吸附率略有减小。所以，以下试验振荡速度选择150 r/min。
2.3 黏土添加量对饲用植酸酶吸附的影响
由图3可知，随着4种黏土添加量的增加，黏土对饲用植酸酶的吸附率也随之增大。4种黏土添加量为0.1 g时，黏土对饲用植酸酶的吸附率为：沸石粉0.045%，蒙脱石28%，酸化凹凸棒土12%，凹凸棒土0.77%。当4种黏土添加量均增加到0.5 g时，吸附率为：沸石粉20%，蒙脱石53%，酸化凹凸棒土55%，凹凸棒土33%，吸附率快速上升。黏土添加量为1.0 g时，吸附率为：沸石粉25%，蒙脱石55%，酸化凹凸棒土60%，凹凸棒土38%。与黏土添加量0.5 g时相比，增加黏土添加量对饲用植酸酶的吸附率虽然有所上升，但是曲线斜率逐渐减小，表明吸附速率随着添加量的增加逐渐减缓，也就是单位质量的黏土对饲用植酸酶的吸附量缓慢下降。综合考虑，黏土的用量均选择0.5 g。
2.4 pH值对黏土吸附饲用植酸酶的影响
由图4可知，4种黏土对饲用植酸酶的吸附率随着pH值的增大而减小，pH值为2.0时，黏土对饲用植酸酶的吸附率分别为：沸石粉94%;蒙脱石94%;酸化凹凸棒土89%;凹凸棒土97%。其原因可能是黏土本身带有负电荷，饲用植酸酶的等电点（pI）在4.5～4.8，黏土对饲用植酸酶的吸附过程本就是一个离子交换与物理吸附协同作用的过程，在pH值﹤5的环境中，饲用植酸酶带正电荷，饲用植酸酶以阳离子形式存在，静电作用可促进离子交换过程，增加黏土对饲用植酸酶的吸附。随着pH值增大，饲用植酸酶所带的负电荷增加，与黏土表面的负电荷产生静电斥力，离子交换减弱，主要是物理吸附在起作用[3]，当pH值为8.0时，黏土对饲用植酸酶的吸附率分别下降为：沸石粉65%，蒙脱石34%，酸化凹凸棒土0，凹凸棒土55%。其中吸附过程受影响较大的是酸化凹凸棒土和蒙脱石，pH值对沸石粉和凹凸棒土吸附饲用植酸酶的影响相对较小。
2.5 黏土对饲用植酸酶的吸附动力学
2.5.1 准一级动力学模型
用ln（Qe-Qt）对t作图得到直线，利用斜率和截距可以求出K1和理论吸附量[5]。
ln（Qe-Qt）=lnQe-K1t。
式中：Qt是t时刻单位质量的吸附剂所吸附的吸附质的量，mg/g;K1为一级动力学模型速率常数，min-1;Qe为吸附达到平衡时的最大吸附量，mg/g;
2.5.2 准二级动力学模型
用t/Qt对t作图得到直线，利用斜率和截距可以求出理论吸附量和K2。
t/Qt=1/（K2Q2e）+t/Qe。
式中：K2为二级动力学吸附速率常数，min-1。
由图5可知，随着时间的变化，4种黏土对饲用植酸酶的吸附均在60 min内快速吸附，120 min后达到吸附平衡。
由图6、图7、表1、表2可知，准二级动力学模型拟合相关系数均大于准一级動力学模型拟合相关系数，计算值与试验所测值更接近，表明4种黏土对饲用植酸酶的吸附动力学更符合准二级动力学模型，可以推测4种黏土对饲用植酸酶的
2.6 黏土对饲用植酸酶的等温吸附
2.6.1 Langmuir吸附模型
通过Ce/Qe对Ce作图得到直线，KL和Qm利用线性方程截距和斜率求出[6-7]。
Qe=（QmKLCe）/（1+KLCe）;
RL=1/（1+KLCe）。
式中：KL为Langmuir模型常数，L/mg;Qm为理论最大吸附量，mg/g;RL为无量纲分离因子;其他符号含义同前。
2.6.2 Freundlich吸附模型
通過lnQe对lnCe作图得到直线，利用线性方程截距和斜率可以求出KF和1/n。
Qe=KFCe1/n。
式中：KF为Freundlich模型常数，可反映吸附容量的大小;n与吸附强度有关，是吸附剂本身的吸附特性，是代表吸附强弱的系数[8]。其他符号含义同前。
由图8、图9、表3、表4可知，对于沸石粉、蒙脱石、酸化凹凸棒土与凹凸棒土，Langmuir模型能够较好地描述4种黏土的吸附等温线，说明这4种黏土吸附剂表面位点是均匀分布的，饲用植酸酶以单层分子的形式吸附在4种黏土表面。此外，对于酸化凹凸棒土，Freundlich拟合相关系数更高，r2=0.999 2，表明饲用植酸酶在酸化凹土棒土上的吸附过程中可能存在不同能量的作用力作用。1/n在0到1之间，其大小可以反映吸附质浓度对吸附量影响的强弱，1/n越小，吸附性能越好。0﹤1/n﹤0.5，说明酸化凹凸棒土对饲用植酸酶具有很好的吸附性能，吸附过程较容易进行[10]。
4种黏土对饲用植酸酶的吸附均为单分子层的吸附，这也证明4种黏土表面分布着均匀的吸附位点并有着相似的亲和力，RL均在0～1之间（表3），吸附过程为优惠吸附，利于吸附质与吸附剂之间发生吸附反应。
3 结论
沸石粉、蒙脱石以及凹凸棒土等黏土价格低廉，且具有良好的吸附、润滑、黏合及膨胀等理化特性，常用作饲料的添加剂、黏合剂[9]，还可以解决一部分畜禽营养上的不足以及由于营养缺乏而造成的动物免疫力低下及相关的疾病，从而改善畜禽的生产性能[11]。本试验所使用的植酸酶为饲用植酸酶， 含有黑曲霉或毕赤酵母、葡萄糖等物质，如果直接称量饲用植酸酶进行试验，会对试验产生干扰，所以本试验使用按照GB/T 18634—2009[CM（17*2]《饲用植酸酶活性的测定 分光光度法》中酶制剂提取方法进行提取，得到的饲用植酸酶溶液进行吸附研究。
与蒙脱石、酸化凹凸棒土相比，凹凸棒土和沸石粉对饲用植酸酶的吸附量较小，其原因与黏土矿物的种类有关。凹凸棒土经酸化改性后，黏土粒度减小，比表面积增大，孔道增多，所以对饲用植酸酶的吸附力相比较凹凸棒土得到提高[12];沸石粉较沸石颗粒虽然比表面积增加，但是由于沸石形成条件较为复杂，孔道较小，吸附速率较慢，对饲用植酸酶的吸附量较低，导致其对饲用植酸酶的吸附量远小于蒙脱石等[13];蒙脱石层间距大且带有很多阳离子，其晶层对阳离子的吸附力弱，容易与饲用植酸酶发生离子交换和静电作用而吸附。蒙脱石对饲用植酸酶的吸附机制与植酸酶纯品一致，但是吸附量远远小于蒙脱石对植酸酶纯品的吸附量[3]，究其原因，主要是饲用植酸酶中杂质多，即便经过提取，仍然存在可溶性的干扰成分，影响吸附作用，且饲用植酸酶浓度较小，在一定体积范围内与黏土的接触面积小，无法吸附完全。
试验结果表明，4种黏土对饲用植酸酶吸附速率很快，在开始吸附的60 min内，大部分饲用植酸酶都被吸附通过Langmuir和Freundlich模型对等温吸附过程进行拟合，4种黏土对植酸酶的吸附均为单分子层吸附。准二级动力学模型较好地拟合了4种黏土对饲用植酸酶的动力学吸附试验数据，4种黏土主要由化学吸附为主要控制速率。
在饲料混合过程中，加入饲用植酸酶和黏土后，吸附作用随即产生。在pH值为2～8时，随着pH值的增加，黏土对饲用植酸酶的吸附量逐渐减少，当混合饲料到达胃部，环境pH值在2左右时，4种黏土对饲用植酸酶的吸附均达到90%以上。建议实际生产饲用植酸酶时加入保护剂，将酶与外界环境隔开，保护剂应选用容易成膜且在酸性环境中不易分解的材料，这样在饲料混合过程中可以避免饲用植酸酶与黏土之间接触，防止发生吸附作用，从而保护酶制剂功效的正常发挥。
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