应用响应面法优化软枣猕猴桃的一步成苗培养基

2019-12-16赵春莉姚思扬王嫚王一飞吴双汤昊胡钊源

江苏农业科学 2019年19期

赵春莉　姚思扬　王嫚　王一飞　吴双　汤昊　胡钊源

摘要：以软枣猕猴桃带芽茎段为外植体，利用响应面法对其组培一步成苗试验进行优化。在单因素的试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以6-BA、NAA、IBA的浓度为试验因子，植株再生频率为响应值，进行3因素3水平的试验设计。结果表明：3因素对植株再生频率的影响力大小为6-BA的浓度>IBA的浓度>NAA的浓度，最终得到的二元回归方程显示，一步成苗的培养基优化结果为MS+6-BA 2.42 mg/L+NAA 0.27 mg/L+IBA 0.32 mg/L。在此条件下，最佳再生频率预测值为4.23，实际操作结果为4.13。

关键词：响应面;一步成苗;再生频率;软枣猕猴桃;单因素试验;回归分析;再生频率

中图分类号： S663.404+.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）19-0061-04

收稿日期：2018-07-12

基金项目：吉林省重点科技攻关项目（编号：20140204030NY、20140101271JC）;大学生创新创业训练计划（编号：2017496）。

作者简介：赵春莉（1973—），女，山东寿光人，博士，副教授，主要从事观赏植物资源引种驯化及繁殖技术研究。E-mail：zcl8368@163.com。

软枣猕猴桃（Actinidia arguta）是猕猴桃科猕猴桃属植物，分布广阔，产量高，果实甜度高，富含维生素C、蛋白、氨基酸、果胶等成分，其中维生素C含量高达430.8 mg/100 g，是苹果、梨的80～100倍，柑橘的5～10倍[1]，有极高的营养价值，还可加工成果脯、果汁、罐头果酱、酒类等产品[2]。其根、茎、叶均可入药，可治疗消化不良、腹泻、呕吐和风湿性关节痛，有抗衰防癌的功效[3]。猕猴桃适应能力强，种植范围较广，根系发达，可有效保持水土，提高土壤肥力，有良好的生态价值[4]。在园林景观应用上，它是一种很好的缠绕木，可作庭院景观观赏，可应用在花架花棚的设计中[5]。软枣猕猴桃应用广泛，具有良好的食用、药用、生态、景观价值，具有广阔的经济市场。

软枣猕猴桃传统的繁殖方式为播种繁殖和扦插繁殖[6-8]，但种子繁殖易性状分离，生长缓慢。扦插生根率不高，过度采集枝条有损母株[9]。组织培养可以保留植株优良性状，可快速大量地繁殖出苗。目前，已有相关软枣猕猴桃组织培养的报道[9-12]。传统的组织培养试验是在每个阶段筛选出合适的培养基和培养环境，转接过程可能会造成污染，工作量大，周期长。一步成苗指在一个培养基内完成诱导、增殖、生根阶段，可节省成本，节省时间。目前，一步成苗技术还不够成熟，软枣猕猴桃的一步成苗研究未见报道。响应面分析法普遍应用于优化试验中，可精确地反映各因素间的关系，预测出最佳优化条件。本试验以软枣猕猴桃带芽茎段为外植体，研究单因素6-BA、IBA、NAA浓度对其一步成苗的影響，用响应面法优化软枣猕猴桃一步成苗培养基，以期为今后相关研究提供理论实践基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为长白山野生软枣猕猴桃带芽茎段，于2017年5月采自吉林长白山地区，后用低温保温箱将外植体带回吉林农业大学园艺学院实验室进行研究。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的灭菌处理

将外植体用洗洁精洗净灰尘，再用流水冲洗1 h。放在超净工作台的滤纸上吸干水分，放入灭菌后的烧杯中。加75%乙醇消毒30 s，用蒸馏水清洗4次，加0.1%三氯甲烷消毒6 min，用蒸馏水冲洗5次。消毒期间不断振荡，使试剂与材料充分接触。

1.2.2 单因素试验 [HJ1.4mm]

为探究每种生长激素的不同浓度对外植体产生的影响，以MS为基本培养基，将6-BA、IBA、NAA分别设置5种浓度：6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L）;NAA（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L）;IBA（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L）。将外植体分别接种到培养基内，每个处理接15个茎段，培养周期为50 d。

[CM（26]1.2.3 软枣猕猴桃一步成苗培养基的优化

在单因素试验的基础上，用响应面分析法，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以6-BA、NAA、IBA浓度为试验因子，植株再生频率为响应值，进行3因素3水平的试验设计，结果见表1，每个水平处理10个茎段，培养周期为50 d。

1.2.4 培养条件

基础培养基为MS培养基，加入蔗糖 30 g/L、琼脂粉8 g/L，pH值5.8～6.0。培养环境为：温度（25±2） ℃，光照度2 000 lx，每天光照14 h。

1.2.5 数据分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析。

诱导率=出不定芽的外植体/接种的外植体数×100%;植株再生频率=再生植株总数/接种的外植体数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同6-BA浓度对外植体的影响

6-BA是一种常用的细胞分裂素，对细胞生长分化有良好的促进作用。外植体接种15 d左右，有嫩绿色芽点产生，逐渐长大成为不定芽，30 d后部分不定芽会增殖出多个不定芽，当6-BA浓度为10、2.0、3.0 mg/L时，诱导率和增殖效果较好。当6-BA浓度为 4.0 mg/L 时，诱导率和再生频率都有所下降，可见浓度过高的 6-BA对外植体生长分化有抑制作用。50 d后，有部分不定芽长出须根，6-BA浓度为2.0 mg/L时，生根率较好，植株再生频率最高。

2.1.2 不同NAA浓度对外植体的影响

由表3可知，低浓度的NAA对诱导与增殖的效果都很差，在NAA浓度大于 0.10 mg/L 时，诱导速度慢，25 d后才有不定芽形成，形成的不定芽少。在NAA浓度为0.20，0.40 mg/L时，20 d后即可诱导出不定芽，且30 d后增殖的不定芽较多;NAA浓度为 0.80 mg/L 时，对不定芽生长有抑制作用。50 d后，部分不定芽有根系生成，其中处理B3、B4的生根效果较好。最终筛选出最适宜外植体诱导分化的NAA最佳浓度为0.20 mg/L，最佳诱导率为60.00%，植株再生频率为1.13。可见，单独使用生长素NAA对植株再生效果不佳。

2.1.3 不同IBA浓度对外植体的影响

由表4可见，IBA浓度为0.05 mg/L時，诱导和增殖效果差。IBA浓度在 0.10 mg/L 以上时，20 d后有不定芽形成，诱导率较高，不定芽较多。随着IBA浓度升高，诱导率和再生频率都升高，30 d后增殖效果较明显，50 d后，不定芽形成根且根系健壮。IBA浓度在0.80 mg/L时，再生苗的再生频率有所下降。可见，IBA诱导外植体分化的最佳浓度为0.40 mg/L，再生频率为1.27。

2.2 软枣猕猴桃一步成苗培养基的优化试验结果

2.2.1 回归方程分析

以6-BA浓度（X1）、NAA浓度（X2）、IBA浓度（X3）为自因素，以植株再生频率（Y）为响应值，根据试验结果（表5）得到回归方程为：

Y=4.10+0.44X1-0.25X2+0.29X3-0.13X1X2-0.15X1X3+0.42X2X3-0.53X21-0.80X22-0.87X23，R2=0.964 0。该回归模型的P值=0.000 3<0.01，有极显著性;失拟项F值=0.177 6>0.05，无显著性。说明该方程模型拟合度较好，试验误差较小。表6显示，X1、X12、X22、X32回归系数极显著（P<0.01），X2、X3、X2X3回归系数显著（P<0.05）。说明因素6-BA浓度对植物再生频率有极显著影响，IBA浓度与NAA浓度对其有显著影响，且NAA浓度与IBA浓度的交互作用对植株再生频率有显著性影响。6-BA浓度与NAA浓度、IBA浓度的交互作用对结果影响不显著。

2.2.2 响应面分析

通过Design-Expert 8.0.6软件绘制因素间交互作用的等高线图和响应面图，结果见图1至图3，通过等高线、响应面形状来分析因素之间的交互作用以及对再生频率的影响。其中，6-BA浓度对植株再生频率的影响最大，其次是IBA浓度，对植株再生频率影响最小的是NAA浓度。由此可以看出，存在最高点，所以最佳再生频率出现在所选因素水平的范围之内。6-BA浓度与NAA浓度、IBA浓度的响应面坡度较为平缓，对再生频率的影响不显著。NAA浓度与IBA浓度的响应面最高点位于中间，边缘形状较陡，呈明显凸字形，故NAA浓度与IBA浓度的交互作用对再生频率有极显著影响。

2.2.3 模拟方程的验证试验

通过二次回归方程的分析可得出软枣猕猴桃一步成苗的最优条件为：6-BA浓度 2.42 mg/L，NAA浓度0.27 mg/L，IBA浓度0.32 mg/L，最佳再生频率预测值为4.23。对该模型进行3次验证试验，每次处理10个茎段，得出的3次结果为4.3、3.9、4.2，平均结果为 4.13，与预测值十分接近，说明方程与真实试验拟合度较好，该优化方案有实际意义和可行度。

3 讨论与结论

关于软枣猕猴桃的组培研究，通常要经过诱导、增殖、生根的阶段，要统计诱导率、增殖率、生根率，每个阶段都须要筛选出最佳培养基，一般每个阶段需要20～30 d[13]，成苗至少需要80 d。一步成苗所有阶段在1个培养基内进行，并能产生完整植株，大大节省了成本、时间、人力，是一种新型的组培方法。试验选择了6-BA、IBA、NAA 3种植物激素，其中细胞分裂素6-BA对外植体的诱导、分化、增殖有很好的促进作用，生长素IBA、NAA对植物生长、生根都有很好的效果。单因素试验中6-BA对不定芽诱导的效果要好于IBA和NAA，有研究[14]筛选出最适合软枣猕猴桃诱导的6-BA浓度是 1.5 mg/L，诱导率最高85.91%。本试验发现2.0 mg/L 6-BA诱导效果更好，可达86.67%。

一步成苗最重要的参数是植株再生频率，统计的是再生的带有根系的完整植株，不同于传统组培方法统计的增殖系数。接种30 d后，大部分植株基部有增殖的丛生芽产生，也有在茎段上增殖的现象，但这种幼嫩芽苗不计入试验结果。有研究在软枣猕猴桃增殖阶段的增殖系数最高可达5.86，高于本次试验的植株再生频率，但该试验从接种到生根阶段培养了80 d，本试验从接种到生根仅需50 d，减短了试验周期，简化了试验步骤，节省了试验成本，为软枣猕猴桃组培苗的高效工厂化生产提供了理论技术支持[13-14]。

响应面分析法是用多元二次回归方程将试验中的多种因素进行拟合，通过对响应面和等高线的分析，研究各因子与响应值的关系[15]。相对于传统试验方法，响应面是一种试验次数少、回归方程更为精准、能反映各因素间交互作用的一种高效、经济、实用的分析方法[16-17]。由优化试验得出的结果可知，最佳优化培养基为：MS+6-BA 2.42 mg/L+NAA 0.27 mg/L+IBA 0.32 mg/L，植株再生频率为4.23，高于单因素试验的最佳值1.60，说明该优化方案有可行性和实际意义。

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