结核感染T细胞检测(TB-IGRA)在不典型肺结核诊断中的应用

吴丽华，邹细平

(萍乡市第三人民医院，江西 萍乡337000)

肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一类呼吸系统慢性传染病，是目前全球最严重，造成死亡人数最多的单一传染性疾病[1]。我国是全球结核病高负担国家之一,根据2010年全国第5次结核病流行病学调查显示[2],我国现有活动性结核患者52 3万,占全球发病的14.3%。随着环境污染的加重、抗生素的使用、免疫缺陷患者的增加和近年来免疫抑制剂和激素的广泛应用等原因,使部分人群患肺结核可在症状、体征、和胸部X片表现及临床经过等各方面与一般肺结核患者有许多不同特点，即所谓“不典型肺结核”。不典型肺结核占肺结核发病总数的25%左右[3]，且无症状肺结核患者的比例逐渐增加,而传统的实验室诊断方法阳性检出率低[4-5],易造成临床误诊漏诊。因此，探索一种敏感度高、特异性好的检测方法对于结核病的早发现、早诊断、早治疗尤为重要。

结核感染T细胞检测(TB-IGRA)是一种新的诊断结核病的细胞学检测技术,人体感染结核分枝杆菌后，能产生特异性T淋巴细胞，并存在于外周血中，外周血中的特异性T淋巴细胞再次接触到结核抗原后被激活，并分泌γ-干扰素.IGRAs采用结核分枝杆菌特异重组抗原在体外对待检者的全血或外周血单个核细胞进行特异型刺激,再通过体外特异性免疫应答水平的定量分析来判断受检者结核分枝杆菌感染情况。目前体外特异性免疫应答水平的定量分析方法包括通过ELISA试验（TBIGRA）定量检测全血中γ-干扰素水平和通过ELISPOT（酶联免疫斑点法）对体外特异性免疫应答的T淋巴细胞进行计数来定量分析。两者相比较，TB-IGRA在操作简便性和检测灵活性上更具有优势,更适用于临床使用[6]。本研究通过对本院就诊患者中疑似或待排肺结核患者65人分别使用结核抗体检测（TB-DOT）、结核菌素试验(PPD)和结核感染T细胞（TB-IGRA）检测并评价各检测项目敏感性和特异性，现报告如下：

1 材料和方法

1.1 一般资料 研究对象为2017年1月-2018年3月在我院就诊患者中疑似或待排肺结核患者65例,其中男性38例、女性27例。根据肺结核诊断标准（WS288-2008）最终确诊 42例（设为观察组），其中男性25例,女性17例,平均年龄49.29±17.41岁；排除肺结核23例（对照组）,其中男性13例,女性10例,平均年龄48.43±13.33岁。两组间性别、年龄等资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 纳入研究对象标准 ⑴痰涂片找结核菌阴性，胸部X片检查提示疑为肺结核；⑵痰涂片找结核菌阴性，胸部X片检查提示肺部阴影，有咳嗽、咳痰、低烧等不典型症状。排除标准：⑴严重心血管疾病患者；⑵急性传染病患者；⑶肺结核病史等影响因素。

1.3 仪器和试剂 上海科华ST-360酶标仪;上海奥普生物医药有限公司生产的金标数码定量分析仪；结核感染T细胞检测（体外释放酶联免疫吸附法）试剂盒由北京万泰生物公司生产；卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD）由成都生物制品研究所有限责任公司生产;结核分枝杆菌抗体试剂由上海奥普生物医药有限公司生产；肝素抗凝管由美国BD公司生产。

1.4 方法 入选患者分别在早晨同时采集空腹血液标本,进行肝素抗凝外周静脉血结核感染T细胞检测（TB-IGRA）、血清结核抗体检测（TB-DOT）并进行结核菌素试验(PPD)。

1.4.1 外周血结核T细胞检测 ⑴IFN-γ的体外释放：①采用静脉穿刺使用无内毒素肝素抗凝真空采血管采集不少于4ml静脉全血；②2h内将全血标本轻柔颠倒混匀3~5次后分装到N（本底对照管）、T（测试管）、P（阳性对照管）三种培养管中,1ml/管。③培养：将培养管轻柔颠倒混匀5次后迅速置入37℃培养22±2h，培养过程中需保持培养管直立。④离心：培养后的培养管以3000~5000r/min离心10min，取血浆进行ELISA检测，注意不可吸到细胞层。⑵IFN-γ的定量检测：采用ELISA法,以校准 品 （12.5pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200 pg/ml、400pg/ml）的抗原含量及其对应的吸光度值制作标准曲线，求出线性回归方程，将N、T、P三种培养管测得的吸光度值分别代入回归方程，求得三种培养管血浆IFN-γ含量。⑶IFN-γ的阳性判定：按照试剂盒说明书进行,以T管与N管含量差值即（T-N）≥14,并且≥N/4,结果判定为阳性。

1.4.2 结核菌素试验 以PPD试剂0.1ml（5IU）于左前臂内侧中上1/3处皮内注射，经48~72h后观察注射部位硬结平均直径[（横径+纵径）/2]，硬结＜5mm为阴性，5~9mm为弱阳性，10~19mm为阳性,≥20mm（或＜20mm但有水疱或坏死时）为强阳性。本研究将硬结≥5mm（或出现水疱或坏死时）均视为阳性。

1.4.3 结核抗体检测 使用新鲜血清采用斑点免疫胶体金渗滤技术,对结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原进行分离纯化,再在硝酸纤维素膜上点样并固化,膜上的结核抗原会和人血清中的结核分枝杆菌抗体进行结合，再用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物和结合之后的结核IgG抗体成色呈色，通过金标数码定量分析仪进行结果判定。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件包进行数据处理与统计分析，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用t检验；计数资料以频数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 通过对非典型肺结核组（观察组）与非肺结核组（对照组）一般资料和症状体征比较，两组研究对象在发热和盗汗症状人数比较时差异有统计学意义(P＜0.05)。 见表 1。

表1 观察组与对照组一般资料和症状体征比较

2.2 非典型肺结核组（观察组）与非肺结核组（对照组）外周血TB-IGRA检测、血清TB-DOT检测和PPD试验阳性率结果比较 两组外周血TB-IGRA检测、血清TB-DOT检测和PPD试验结果差异有统计学意义(χ2=52.715、9.611、6.460,P=0.000、0.002、0.011)。外周血TB-IGRA检测在非典型肺结核患者诊断中有重要价值,Kappa值为0.900＞0.4。见表2。

2.3 TB-IGRA、TB-DOT、PPD对非典型肺结核的诊断效能比较 血清TB-IGRA检测的灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预期值和符合率均显著高于血清TB-DOT检测和皮肤PPD试验,各组间比较差异有统计学意义(χ2=13.650、8.178、7.536、10.9 77、18.720，P=0.001、0.017、0.023、0.004、0.000)。 见表3。

表2 非典型肺结核组（观察组）与非肺结核组（对照组）结果比较[%（n/n）]

表 3TB-IGRA、TB-DOT、PPD 对非典型肺结核的诊断效能比较（%）

3 讨论

不典型肺结核是发病年龄和部位、临床症状和体征、实验室检查及影像学表现等与常规规律变化不一致的结核[7],因此极易忽视对患者进一步检查诊断,从而造成临床误诊漏诊和结核病的传播。如果能够尽早明确诊断，及时规范治疗后多数患者可以治愈,因此结核病的早期诊断和有效治疗有赖于尽早明确患者是否存在结核菌。传统的检测如涂片染色镜检操作简单,发出报告时间短，但检出率低，同时，涂片检出不能分辨活菌、死菌且多种抗酸杆菌均着色,需进一步试验才能确诊;结核菌培养可以通过观察细菌生长情况并进一步进行菌种鉴定和药敏试验,为临床合理用药和有效治疗提供依据，但时间较长，不能满足临床及时诊断和治疗需求,而PCR法又存在污染风险较高的问题[8]。因此，开发特异、敏感、快速、简单的结核病感染的诊断方法已经成为全球的共识[9]。

本研究通过对非典型肺结核组（观察组）与非肺结核组（对照组）分别进行外周血TB-IGRA检测、血清TB-DOT检测和皮肤PPD试验,从结果比较可以看出,观察组的阳性率分别为95.2%、61.9%、71.4%,对照组的阳性率分别为4.34%、21.7%、39.1%,两组外周血TB-IGRA检测、血清TB-D OT检测和PPD试验结果差异有统计学意义 （χ2=52.715、9.611、6.460,P=0.000、0.002、0.011）。外周血TB-IGRA检测、血清TB-DOT检测 、PPD试验在观察组的灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预期值和＜符合率均显著高于血清TB-DOT检测和皮肤PPD试验,各组间比较差异有统计学意义 （χ2=13.650、8.178、7.536、10.977、18.720,P=0.001、0.017、0.023、0.004、0.000）。 血清结核抗体检测操作简单快速，但存在假阳性和假阴性的问题。本研究中观察组和对照组血清结核抗体的检测差异有统计学意义，诊断符合率为67.7%，Kappa值为0.362＜0.4，说明血清结核抗体与非典型肺结核诊断一致性较差，在相关研究[10-12]中的结核抗体阳性率为30.8%~73.3%。存在较大的变异，所以，2011年WHO建议不再使用结核抗体检测结核感染。PPD试验至今仍广泛使用。但该方法在卡介苗疫苗接种或非结核接触者易出现假阳性,同时在一些特殊人群如HIV感染、全身性感染等人群中易造成假阴性[13],本研究中PPD试验的在非典型肺结核的诊断效能高于血清结核抗体,但价值有限（Kappa值＜0.4）。而TB-IGRA是一种新的用于结核杆菌感染的体外免疫诊断方法，TB-IGRA通过选取存在于结核杆菌,但在卡介苗和大多数非结核杆菌中普遍缺失的RD1区编码的ESAT-6和CFP-10作为结核杆菌特异性抗原,与新鲜采取的肝素钠抗凝全血或者PBMC(外周血单个核细胞)充分混合孵育后,应用酶联免疫法或者免疫斑点法检测特异性γ-干扰素的释放。结果不受卡介苗干扰，提高了结果的特异性。从本结果看TB-IGRA在诊断非典型肺结核的敏感度、特异度明显高于血清结核抗体检测和结核菌素试验,分别为95.2%、95.7%,与黄其俊等[14-15]结果一致,在结核病诊断中具有重要价值和明显优势。

在全球所有传染性疾病中,结核病已成为成年人的首要死亡原因[16]。根据世界卫生组织统计数据显示，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一,被WHO列为结核病高负担、高危险性国家之一[17]。通过酶免法检测外周血中结核感染后特异性细胞因子γ-干扰素来诊断是否存在结核感染已被列入英美等发达国家的临床诊治指南[18]，同时，已获国家卫计委批准并在2018年5月1日实施的肺结核诊断标准WS288-2017中增加了将γ-干扰素释放试验用于结核病的辅助诊断。但由于TBIGRA价格昂贵，在一定程度上限制了此项目的推广应用，另外一方面，TB-IGRA作为结核感染的辅助诊断方法，不能有效区分LTBI和活动性TB，也不能准确预测LTBI发展为活动性结核的风险，同时也不推荐以IGRAs代替PPD试验用于健康人群公共卫生干预中的筛查手段[19]，所以，对结核的诊断、治疗和预防工作任重道远，相信未来可发现更为特异的结核抗原作为刺激原,不断提高结核的早期诊断和治疗水平,有效控制并降低结核病的发生率和死亡率。

综上所述,结核感染T细胞检测在非典型性肺结核的诊断中具有重要价值，同时，全面细致的观察是正确诊断的基础,并及时提出进一步检查的意见，减少误诊率的发生。