寨卡病毒E、NS5蛋白生物信息学分析

邹淑慧，李金亮，廖莎莎，张丽琴，刘聪

（赣州市人民医院检验科，江西 赣州 341000）

至2015年5月以来，寨卡病毒 （Zika Virus，ZIKV）在美洲区域的传播不断升级，疫情逐步恶化，甚至有城市化和全球化传播趋势，对国际公共卫生造成严重威胁[1]。2016年2月，我国出现首例输入性寨卡病毒感染，随后国内陆续出现多例ZIKV感染病例，引起我国政府和卫生部门的广泛关注[2]。

寨卡病毒属黄病毒属，为单股正链RNA，长约11kb，分为亚洲型和非洲型[3]，在系统发生树上与同为黄病毒属的登革热病毒、Spondweni病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒非常相近[4]。寨卡病毒基因编码多聚蛋白，包括病毒衣壳蛋白C，膜前体蛋白PrM，包膜蛋白 E和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。 E 蛋白是病毒表面的主要蛋白，参与调节结合以及膜融合等方面。非结构蛋白中的NS5是病毒中最大的蛋白，含有RNA-依赖RNA聚合酶和甲基转移酶，负责病毒基因组RNA的合成及加帽[5,6]。本研究将从生物信息的角度分析ZIKV E蛋白和 NS5蛋白序列特征，为进一步挖掘其基因信息，研究其致病机制提供分子依据，从而预防和控制寨卡病毒的感染与流行。

1 材料和方法

1.1 序列来源 所有病毒株E和NS5核苷酸、氨基酸序列均来源于GenBank中已登记的黄病毒属相关参考序列。

1.2 ZIKV E、NS5核苷酸与氨基酸同源性比较 用Clustal X和Bioedit软件对ZIKV不同地理株系及同属成员的E、NS5基因及编码蛋白序列进行比对，计算核苷酸与氨基酸同源性。

1.3 ZIKV E、NS5蛋白二级结构分析 选取中国首例分离的ZIKV基因组序列（登陆号：KU744693.1）为研究对象[2]，获取E、NS5基因及氨基酸序列。通过蛋白结构在线预测网站Predict Protein Server（https：//www.predictprotein.org/）分析 E、NS5 蛋白的二级结构，对E、NS5蛋白的氨基酸组成以及蛋白序列可能存在的蛋白结合区、α螺旋区、β折叠区以及卷曲结构区域进行分析，同时预测蛋白结构中可能的暴露区域和隐藏区域。

1.4 ZIKV E、NS5蛋白的跨膜区结构分析 利用在线 软 件 TMHMM v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对E、NS5蛋白氨基酸序列进行跨膜拓扑结构的预测，从而分析跨膜段、膜内段和膜外段的氨基酸序列。

1.5 ZIKV E、NS5蛋白的信号肽分析 应用Anthe-Pro软件分析E、NS5蛋白氨基酸序列中可能存在的潜在信号肽结构。

1.6 ZIKV E、NS5蛋白B细胞抗原表位的预测 运用 Bepipred（http：//tools.iedb.org/bcell/）在线服务器程序预测E、NS5蛋白中可能的B细胞线性表位，得分大于0.350（软件默认值）则预测为优势线性B表位。

2 结果

2.1 ZIKV E、NS5核苷酸与氨基酸同源性分析 通过比较ZIKV不同地理株系及同属成员的E、NS5蛋白核苷酸和氨基酸的同源性，结果显示不同地理株的ZIKV E蛋白核苷酸和氨基酸同源性分别为87.1%～100%和94.2%～100%，跟同黄病毒属其他成员比较，发现与Spondweni病毒更接近，氨基酸同源性最高达72.8%（表1）。不同地理株的ZIKV NS5蛋白核苷酸和氨基酸同源性分别为88%～99.9%和95.5%～100%，跟同黄病毒属其他成员比较，也是与Spondweni病毒更接近，氨基酸同源性最高达77.5%（表2）。

2.2 ZIKV E、NS5蛋白二级结构 E蛋白编码504个氨基酸，可能的蛋白结合位点有14个，主要位于 1～13、55～161、232～394aa 区段；α 螺旋区主要集中在 406～418、436～501aa区段，占 15.28%；β 折叠片主要在 2～73、91～143、165～216、236～401aa 区段，占33.93%；无规则卷曲占50.79%；此外，在蛋白中还可能包含两个跨膜结构区域 （461～479aa、483～501aa）。整个蛋白暴露区域和隐藏区域均匀相间分布，见图1。NS5蛋白编码903个氨基酸，可能的蛋白结合位点有22个，主要位于6～119、247～418、518～744、895～899aa 区段；多聚核苷酸结合位点有两个，位于741aa和856aa；α螺旋区主要集中在 2 ～67、158 ～288、350 ～444、545 ～575、611 ～627、753～888aa区段，占36.88%；β折叠片主要在74～146、578～606、702～743aa 区段，占 11.52%；无规则卷曲占51.60%；整个蛋白暴露区域和隐藏区域均匀相间分布，见图1。

2.3 ZIKV E、NS5蛋白的跨膜区结构 TMHMM预测E蛋白有两个跨膜区域，分别为455～477aa、484～503aa，膜外区域为 1～454aa，膜内区域为 478～483aa，见图2。整个NS5蛋白均位于膜外，无跨膜区域，见图3。

2.4 ZIKV E、NS5蛋白的信号肽 E和NS5蛋白均存在潜在信号肽结构，其信号肽断裂位点分别位于 501aa 和 152aa，见图 4、图 5。

2.3 ZIKV E、NS5蛋白的B细胞抗原表位 运用Bepipred法预测B细胞线性表位，结果显示E蛋白平均抗原性指数为0.062，分子内有多个可能的抗原表位区域。其中分值最高的表位区域为317～342aa，分值达1.919（阈值0.350）；其次为155～181、66～89、226～238、380～384aa （按分值高低排列），见图6。NS5蛋白平均抗原性指数为0.107，分值最高表位区域为100～114aa，分值达2.297；其次为 360～372、148～159、688～707aa，见图 7。

表1 E蛋白核苷酸和氨基酸的同源性比较

表2 NS5蛋白核苷酸和氨基酸的同源性比较

图1 E蛋白二级结构（1A）及组成成分（1B）、NS5蛋白的二级结构（1C）及组成成分（1D）

图2 E蛋白跨膜区域预测

图3 NS5蛋白跨膜区域预测

图4 E蛋白信号肽结构预测

图5 NS5蛋白信号肽结构预测

3 讨论

ZIKV属于黄病毒科黄病毒属的一种虫媒病毒，且是一种人兽共患病毒。寨卡病毒可引起严重的神经系统损害，包括格林巴利综合征（GBS）及新生儿小头畸形，已经成为威胁全球人类健康的潜在因素[7]。目前尚无针对性的预防性疫苗和治疗性药物，因此开发相关疫苗迫在眉睫。

图6 Bepipred工具预测E蛋白的线性B细胞表位

图7 Bepipred工具预测NS5蛋白的线性B细胞表位

在基因组和蛋白质组学时代，基于疫苗开发、单克隆抗体的制备以及快速检测试剂盒的研制，运用生物信息学工具分析蛋白质序列已成为蛋白质研究的重要手段[8]。本文通过生物信息学分析发现不同地理株系的ZIKV E蛋白和NS5蛋白同源性都比较高，提示这两段序列比较保守。跟同黄病毒属其他成员比较，显示与Spondweni病毒关系最近，但同源性也仅有70%多。说明ZIKV虽然与其他黄病毒发病症状相似，但可能已经发展出不同的致病机制。

蛋白质的二级结构对抗原表位影响很大，α螺旋、β折叠的化学键键能较高，成为蛋白质中心的“支架”，很难与合适的抗体嵌合，而β转角和无规则卷曲常位于分子表面，利于抗体结合，成为抗原表位的可能。本研究通过Predict Protein Server分析发现ZIKV E蛋白和NS5蛋白二级结构中无规则卷曲含量最高，分别占50.79%和51.60%，推断这些区域与B细胞表位有关。另外E蛋白和NS5蛋白中还包含有多个可能的蛋白质相互作用位点，提示可能参与多种蛋白或者其他分子之间的相互作用并在ZIKV感染过程中发挥重要作用，可对这些相关功能位点进行深入研究，进一步揭示ZIKV的浸染机制。外膜蛋白通过加强巨噬细胞对抗原的摄取，增强淋巴细胞活化，在免疫反应中表现出重要作用，常作为保护性疫苗候选抗原。跨膜区域预测分析结果显示E蛋白有两个跨膜区域，其中氨基酸1～454位于膜外，而NS5均位于膜外。研究表明抗原表位可能不在这两个跨膜域中[9]。在跨膜蛋白的N端，有一段疏水性氨基酸序列，称为信号肽，新合成的蛋白质通过该信号肽进入正常的分选途径。软件分析表明E蛋白和NS5蛋白含有信号肽，为分泌性蛋白。

抗原优势表位的确定是疫苗研制和临床应用的基础。运用生物信息学方法预测蛋白质的抗原优势表位，并通过体外合成肽段进行实验验证，已广泛应用于蛋白质抗原表位的鉴定[10]。Bepipred方法是结合线性B细胞表位预测的一种经典算法。本研究通过该方法预测发现，ZIKV E蛋白平均抗原性指数为0.062，分子内有多个可能的抗原表位区域， 如：317～342aa、155～181、66～89、226～238、380～384aa。NS5蛋白平均抗原性指数为0.107，可能的表位区域有 100～114aa，、360～372、148～159、688～707aa。对于进一步确认E、NS5蛋白的优势表位信息，需要通过体外试验、动物模型等来进行验证。本研究预测的相关线性表位将为进一步E、NS5蛋白抗原表位的确证及诊疗抗体的开发提供一定的参考依据。

总之，本研究对ZIKV E蛋白和NS5蛋白的生物信息学分析，成功预测到其基本的结构特征和潜在的线性B细胞表位。这将有助于对E、NS5蛋白的深入研究奠定理论基础，为开发ZIKV快速检测的胶体金试剂盒和治疗性抗体提供研究基础。