桂北地区恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和淋巴细胞亚群的相关性研究

周献青 ，杨明 ，晏强 ，陈洁晶 ，戴勇 ，黄锦龙

(1.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541004；2.中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院肾脏科，全军器官移植与透析治疗中心，广西代谢性疾病研究重点实验室，广西 桂林 541002；3.暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院临床医学研究中心，广东 深圳 518020)

肿瘤疾病发展成为严重威胁人类生命健康和生存发展的重大因素,目前全世界的肿瘤发病率呈上升趋势,广西恶性肿瘤防治的重点癌症疾病有肺癌，乳腺癌，鼻咽癌，宫颈癌等[1,2]。肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫状态密切相关。在控制肿瘤细胞生长过程中，细胞免疫发挥重要作用，T细胞介导的特异性免疫尤为重要。T淋巴细胞可以反映人体细胞的免疫功能,是免疫系统的关键[3]。如恶性肿瘤、血液疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等[4]；非特异性免疫细胞也反映了肿瘤细胞的杀伤能力和巨噬细胞的杀菌活性。本研究就桂北地区（桂林市、贺州市）的四种常见恶性肿瘤（鼻咽癌，乳腺癌，宫颈癌和肺癌），通过流式细胞术分析184例癌症患者的T淋巴细胞亚群和淋巴细胞亚群，讨论患者的免疫状态。

1 材料和方法

1.1 标本来源 选取桂北地区（桂林市、贺州市），中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院肿瘤科在2017年1月至12月收治肿瘤患者共184例，男性77例，女性107例，年龄区间在30～70岁，其中94例鼻咽癌，32例乳腺癌，36例宫颈癌，22例肺癌。所有病例均经过病理学明确诊断。同时选取40例健康体检人员，作为正常对照组，符合性别年龄区间，排除近期有感染情况和其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 材料和试剂 采集肿瘤组和正常组的静脉外周血2 ml于乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）的抗凝管中，反复颠倒混合。T淋巴细胞亚群检测试剂盒、淋巴细胞亚群检测试剂盒、溶血素、荧光微球计数试剂（996/μl），试剂盒由美国 Beckman coulter Inc公司提供，严格按照说明书操作。

1.2.2 仪器 检测仪器为Epics XL流式细胞仪，购自美国Beckman coulter Inc公司。

1.2.3 实验过程 ⑴移液枪取50 μl外周血,5 μl抗体，振摇混匀,避光,置于 28°C 水浴锅，15 min；⑵加入溶血素 300 μl,避光,置于 28℃水浴锅,10 min；⑶检测T淋巴细胞亚群上样管中加入50 μl荧光微球试剂；⑷加入PBS磷酸缓冲液500 μl,上机，调取方案,检测。

1.3 统计学处理 本研究采用SPSS17.0统计软件进行独立样本t检验分析。所有数据均具有统计学显着性，平均值±标准差（）测试水平为 0.05（Sig双边）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T淋巴细胞亚群细胞绝对计数 CD3+T细胞与正常组的差异有统计学意义（P=0.000）有显著性差异。正常组和肿瘤组CD4+T细胞的差异有统计学意义（P=0.000）。正常组和肿瘤组CD8+T细胞的差异有统计学意义（P=0.000）。鼻咽癌的CD4+/CD8+比值低于正常组，差异有统计学意义（P=0.000）.乳腺癌(P=0.634）、宫颈癌（P=0.409）、肺癌（P=0.629）较正常组高但差异无统计学意义。见表1。

2.2 淋巴细胞亚群相对计数 鼻咽癌组和正常组CD3+%（P=0.000），CD56+%（P=0.001）的比较差异具有统计学意义。 CD19+%（P=0.067）差异无统计学意义。 乳腺癌组与正常组对比，CD3+%（P=0.453）、CD56+%（P=0.371）、CD19+%（P=0.573）差异无统计学意义。与正常组比较，宫颈癌CD3+%（P=0.000）差异有统计学意义;CD56+%（P=0.094）CD19+%（P=0.235）差异无统计学意义。肺癌组与正常组对比，CD3+%（P=0.157）、CD56+%（P=0.287）、CD19+%（P=0.177）差异无统计学意义。见表2。

表1 T淋巴细胞亚群的绝对细胞计数

3 讨论

人外周血淋巴细胞群由三种细胞组成：T细胞（来自胸腺），B细胞（来自骨髓）和NK细胞（自然杀伤细胞）在免疫系统的功能中起着核心作用。取决于它们的表型和功能，T细胞包括T淋巴细胞测定中的成熟 T细胞 （CD3+）、 辅助/诱导 T细胞（CD4+）、抑制/细胞毒 T 细胞（CD8+）[5]。 用抗原或巨噬细胞活化T淋巴细胞后，某些B细胞（CD19+）分化成产生和分泌特异性免疫球蛋白的浆细胞。NK细胞（CD56+）被认为是离散的细胞溶解受体，在调节细胞生成、保护机体免受病毒感染和消除恶性细胞方面发挥重要作用[6]。

表2 淋巴细胞亚群的相对计数

CD3+T细胞可以反映宿主细胞的免疫状态。CD4+T细胞主要为辅助性淋巴细胞，具有免疫记忆功能和直接杀伤肿瘤细胞功能,可分泌多种免疫抑制因子，如IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ等,抑制肿瘤生长及转移。本研究中,肿瘤组CD3+T细胞和CD4+T细胞值低于正常组,差异有统计学意义,与多位学者报道结果一致[7-10]。在癌症患者中，受多种抑制因子的影响，机体处于免疫抑制状态，导致抑制CD4+T细胞的分化和成熟。从而造成CD3+T细胞和CD4+T细胞的免疫功能低下。

CD8+T细胞可分化为细胞毒性T细胞（CTL），对细胞具有一定的杀伤作用，可抑制免疫应答，对细胞免疫进行负调节。在本研究中，肿瘤各组的CD8+T细胞低于正常组，差异有统计学意义。CD8+T细胞价值的变化更为复杂，学术界没有统一的结果。李月亚等[3]认为肺癌患者CD8+T细胞比例显著高于对照组。它表明肺癌免疫系统可以产生更多的CD8+T细胞并直接杀伤肿瘤细胞；但有学者[11]发现肺癌患者外周血CD8+T细胞比例下降，肺癌患者CD8+T细胞表面特异性受体结构发生改变。效应T细胞识别并结合靶标，反馈会导致CD8+T细胞比例下降，从而导致肿瘤细胞免疫逃离，CD8+T细胞比例下降。郑惠源等[12]提出，鼻咽癌患者外周血淋巴细胞亚群治疗前CD8+T细胞水平明显高于正常对照组。而CD8+T细胞水平在治疗后明显下降。 梁新强等[13]在乳腺癌研究中，疾病组CD8+T细胞水平高于正常组，差异有统计学意义。其原因被认为是产生肿瘤衍生细胞因子的恶性肿瘤中恶性细胞的生长。谭秋梅认为[14]，在宫颈癌研究中，CD8+T细胞的水平显著高于正常组。在司远征的研究中，鼻窦炎患者的免疫功能处于失衡状态，细胞的免疫功能出现损伤，患者的T淋巴细胞亚群各项结果均低于健康对照组[15]。

CD4+/CD8+比值是调节细胞免疫的重要部分，以维持免疫应答的相对平衡,并且是维持机体正常细胞免疫的重要因素。当自身免疫性疾病或肿瘤发生时，CD4+/CD8+比值下降，患者处于免疫抑制状态[16]。本研究中鼻咽癌的CD4+/CD8+比值低于正常组，差异有统计学意义（P=0.000）。说明鼻咽癌患者细胞免疫功能降低，机体免疫功能失调。在治疗之前，CD4+/CD8+比值较低,但在治疗后不断提高，表明患者的免疫功能有不同程度地恢复[12]。乳腺癌、宫颈癌、肺癌都略微高于正常组，但差异不明显，无统计学意义，患者在临床治疗中是有效的，可以减少免疫抑制因子释放肿瘤细胞,因此患者病情有所改善。在于鸿[17]提出的成果中，宫颈癌患者CD4+/CD8+比值与对照组比较差异无统计学意义，但是随着患者临床分型呈降低趋势。

自然杀伤（NK）细胞来源于骨髓造血组织，属于先天免疫系统,在人体免疫系统中起着重要作用。NK细胞的激活不需要抗原呈递,也不需要MHC限制，独立于抗体和快速激活[18]。NK细胞是体内重要的免疫细胞，短期内具有增殖力大、免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老等特点，NK细胞不仅参与抗病毒感染，肿瘤和免疫调节，还参与某些情况下自身免疫性疾病的发生,受到普遍关注，临床应用也显示出巨大潜力和广阔前景[19]。本研究中，鼻咽癌NK细胞相对计数（CD56+%）高于正常组，差异有统计学意义（P=0.001），讨论可能与诱导鼻咽癌恶性细胞增殖产生的肿瘤衍生细胞因子有关。NK细胞相对计数（CD56+%）在乳腺癌中略低于正常组，但差异无统计学意义（P=0.371），猜测癌细胞未转移，对免疫系统影响不大，与孙智[10]做出的结果相似。宫颈癌和肺癌中NK细胞相对计数（CD56+%）略高于正常组，但差异无统计学意义。

B细胞是具有初级体液免疫功能的淋巴细胞[20]。本研究中，肿瘤组与正常组之间差异无统计学意义。还需要结合患者药物疗法，免疫疗法，辅助疗法等进行进一步研究。章梁君等[21]认为，某些肿瘤患者的B细胞相对计数（CD19+%）与正常组对比差异无统计学意义，有可能说明在体液免疫中B细胞在恶性肿瘤疾病中影响较小。肺癌病人外周血流式检测B细胞表面因子CD19+CD20-，结果显示，在肺癌转移患者高于未转移患者，B细胞高表达抑制性分子；但是存在归巢障碍,可能不能到达刺激淋巴器官，有效启动体液免疫应答[22]。

综上所述,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群和淋巴细胞亚群是帮助诊断患者免疫功能是否正常的重要指标，在免疫监视、杀伤靶细胞和免疫调节等方面影响力较大。细胞免疫在肿瘤疾病的发展和治疗中起着重要作用。T淋巴细胞亚群和淋巴细胞亚群检测的细胞因子,在免疫过程中互相促进或者抑制,对患者机体免疫功能的失衡和抗肿瘤免疫起着重要的作用。使用流式细胞术检测癌症患的T淋巴细胞亚群和淋巴细胞亚群，评估患者的状况，身体免疫情况实时监测、后期治疗指导用药具有一定的临床应用价值。