γ干扰素释放试验在HIV合并TB感染中的应用价值

边泽源，杨云红，吴芝炜，张齐龙，熊玉红

（江西省胸科医院检验科，江西 南昌 330006）

全球近3400万HIV感染者中，有超过1/3合并感染TB（包括潜伏感染），HIV合并TB感染者结核发病率是单纯TB感染者的30倍[1]。数据统计显示，我国艾滋病患者中结核病的感染率达29.1%，结核病已经成为艾滋病患者就诊、入院和死亡的主要原因,严重影响到艾滋病患者的预后和生存质量[2,3]。相比于非免疫缺陷者，HIV感染者更容易重新激活体内潜伏性感染结核分枝杆菌并发展为弥漫性感染，病情迅速恶化甚至死亡[4,5]，因此早期诊断HIV合并TB感染、及时发现隐匿性TB，对控制HIV合并结核分枝杆菌感染、降低其住院率及病死率，具有重要意义。本研究回顾性分析四种TB诊断方法在HIV合并TB感染患者中的诊断价值，报告如下。

1 研究对象与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月-2017年12月我院确诊HIV合并TB感染的患者资料40例，男31例，女9例；年龄44.95±13.18岁。同期HIV未合并TB感染的患者资料40例,男29例,女11例；年龄45.9±15.31岁。艾滋病诊断符合艾滋病诊疗指南(2011版)的诊断标准[6]。肺结核均依据临床表现，细菌学，影像学或抗结核药物治疗确诊，诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册（结核病分册）》诊断标准[7]。

1.2 主要仪器与试剂 γ干扰素释放试剂盒 （英国Oxford Immunotec Ltd.），人型结核菌素纯蛋白衍生物试剂(Purified protein derivative，PPD)（北京祥瑞生物制品有限公司），结核分枝杆菌抗体检测试剂盒（成都永安制药有限公司）

1.3 方法

1.3.1 γ干扰素释放试验 采血前嘱咐患者空腹8h以上，以含抗凝剂柠檬酸钠的采血管采集肘静脉血10ml，尽快分离单个核细胞(PBMC)，用细胞培养液重悬细胞备用。将包被抗IFN-7抗体的微量板平衡至室温,向4个孔中分别加入结核分枝杆菌特异混合多肽 A（含 ESAT-6）和 B（含 CFP-10），阴性对照细胞培养液，阳性对照植物血凝素(PHA)。然后，各孔分别加入含250 000个细胞的上述单个核细胞悬液。37℃培养16～20 h后，用PBS液洗板4次，各孔分别加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN单抗，2～8℃孵育1 h。取出后用PBS液洗板4次。各孔分别加入显色底物液BCIP／NBTPLUS，室温中静置7 min后观察结果。当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果：⑴如果阴性对照孔斑点数为0～5个,测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6。⑵如果阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。注意：阳性对照孔不出现斑点，说明试验不成功。

1.3.2 痰涂片找抗酸菌检测 抗酸染色镜检严格按照中国防痨协会制定的 《结核病诊断实验室检验规程》[8]进行。

1.3.3 结核分支杆菌素PPD 消毒皮肤，在左前臂背侧上1/3处，皮内注射5 U人型结核分支杆菌素纯蛋白衍生物（Montous法，l：2 000)。 结果判断按照《全国结核病防治工作手册》规定标准进行：在试验72 h后，硬结平均直径=(横径+纵径)/2。硬结直径≥5个者或有水疱、破溃者为PPD试验阳性。无红肿硬结者为阴性。

1.3.4 血清结核抗体检测 采用结核分枝杆菌抗体检测试剂盒进行分析,具体步骤及判断方法严格按照说明书进行操作。

1.4 统汁方法 检测结果均用阳性率表示,运用SPSS19.0统计软件,采用配对χ2检验对各组阳性检出率进行统计学分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四种检测方法在HIV合并TB患者中阳性检出率的比较 40例HIV合并TB感染患者，γ干扰素释放试验诊断HIV合并TB感染敏感性为65.0%（26/40）、特异性为97.5%，其敏感性显著优于痰找抗酸杆菌 17.0%（7/40），PPD 15%(6/40)和结核抗体40.0%(16/40)(P＜0.05)。且γ干扰素释放试验在免疫严重抑制（CD4＜100/mm3）患者中敏感性＞60.0%。40例HIV未合并TB感染患者，γ干扰素释放试验假阳性2.5%(1/40)，而结核抗体假阳性率为 32.5%(13/40)。

2.2 CD4细胞计数水平对4种试验阳性检出率比较 按CD4细胞计数水平高低分为CD4＜100/m m3(17 例)，CD4(101～200)/mm3(15 例),CD4(201～500)/mm3(8 例)，CD4＞500/mm3(0 例)。γ 干扰素释放试验在各组阳性检测率均高于其余3种试验，且在免疫不同组中检测阳性率无统计学差异。见表1。

表1 CD4细胞计数水平对4种试验阳性检出率的影响

3 讨论

HIV合并肺结核分枝杆菌感染初期，临床症状不典型，肺部影像学也难以判断，传统的痰涂片找抗酸杆菌和痰结核菌培养，仍是TB感染诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养时间亦长，给结核病的早期诊断与治疗带来困难。γ干扰素释放试验（TB-interferon gamma release assay,TB-IGRA)是一种体外检测TB致敏T淋巴细胞的结核感染诊断方法。该方法利用结核分枝杆菌特异性抗原作为刺激物，结合酶联免疫技术的放大优势,研究报道对潜伏性TB感染的诊断具有较高的敏感性和特异性[9,10]。

本研究采用4种实验对HIV合并TB感染患者进行检测分析，结果显示，TB-IGRA实验的阳性率为65.0%，与李春梦等[11]报道的基本一致，明显高于PPD试验、结核抗体及痰涂片检测结果。且在CD4细胞不同组阳性检测率均高于其余3种方法，即使在免疫严重受抑制的患者中TB-IGRA检测阳性率也达到60.0%。比较显示,传统的痰找抗酸杆菌、PPD试验和结核抗体等方法在检测HIV感染合并TB中均存在不同的局限性。尤其值得一提的是，由于我国大面积接种卡介苗，导致 PPD试验存在假阳性，且对于HIV感染合并TB患者属于免疫低下人群，也存在一定的假阴性率[12]。有研究表明HIV感染后细胞免疫应答和变态反应受到抑制，PPD试验的阳性检出率降低至15%～40%[13]。结核抗体常规检测方法较复杂,并且也受到患者免疫力及抗原特异性的影响，对HIV合并TB患者诊断意义有限。痰涂片作为HIV合并肺结核分枝杆菌感染诊断和疗效观察最直接、简便的检验方法，但其受标本质量，检验人员主观影响大，漏检率较高。刘艳等[14]报道，对HIV疑似感染分枝杆菌患者标本139人份标本进行直接涂片检到的抗酸分枝杆菌仅9例；TB-IGRA主要检测TB患者体内存在特异的效应T淋巴细胞。当这部分T淋巴细胞在体外再次受到结核杆菌特异抗原(ESAT-6与CF P-10)的刺激时，会分泌释放 IFN-γ，因此，通过检测IFN-γ的水平可以判断机体是否存在结核感染[15]。虽然在HIV感染后导致 CD4+T细胞下降，但是 CD8+T细胞和 γδ+T细胞也可以少量分泌IFN-γ，所以即使免疫严重受抑制，仍不受影响。

综上所述,TB-IGRA方法,由于其对结核诊断的高敏感性和高特异性，且不易受患者免疫状态的影响，很受临床医生的青睐，短短几年，已在临床得到广泛应用，已成为临床诊断结核的常规检测方法。本文结果也显示，TB-IGRA方法对早期诊断HIV患者合并TB感染明显优异传统的实验室检测方法。